β－catenin和MMP－2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

孔康寶，李光虎，楊 波，崔永生

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胸外科，吉林 長春130021）

肺癌作為一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來一直呈上升趨勢，并且死亡率已成為各種腫瘤之首。肺癌的發(fā)生是多因素、多基因、多階段共同參與的結(jié)果，其中細(xì)胞信號Wnt途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)對其發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。近年來研究中發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中β－catenin的異常蓄積，且其異常蓄積的程度與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP－2（matrix metalloproteinase－2，基質(zhì)金屬蛋白酶－2）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，其主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白（主要是IV型膠原蛋白）促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于MMP－2在肺癌組織中的表達(dá)情況及其與β－catenin的相互關(guān)系的研究甚少，為此，本實驗對肺鱗癌和肺腺癌及正常肺組織中的β－catenin和MMP－2的表達(dá)情況進行研究，并分析二者與臨床病理因素的關(guān)系，以探討它們在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用與意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2012年4月至8月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本，對其中資料完整的39例進行研究，術(shù)前均未進行放化療。其中，男性27例，女性12例，年齡43－76歲，平均年齡59歲；經(jīng)病理證實的鱗癌19例，腺癌20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例；腫物大?。?cm×3cm×3cm者12例，≥3cm×3cm×3cm者27例；另取8例正常肺組織作為對照。

1.2 主要試劑 β－catenin鼠抗人單克隆抗體及免疫組化試劑盒和MMP－2單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白－過氧化物酶免疫組化法（S－P法）檢測 β－catenin蛋白表達(dá)。以 0.01%mol／L PBS代替一抗作為陰性對照。已知陽性肺癌組織作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 β－catenin蛋白棕黃色顆粒定位于胞膜和胞質(zhì)。有棕黃色顆粒為＋，無棕黃色顆粒為－。MMP－2棕黃色顆粒主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)亦有不同程度的表達(dá)。有棕黃色顆粒為＋，無棕黃色顆粒為－。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計 通過整理染色標(biāo)本的臨床資料、病理資料并將其與細(xì)胞計數(shù)結(jié)果錄入Excel和SPSS表格，我們用SPSS13.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析（不同臨床病理特征比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法檢驗，表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析）。

2 結(jié)果

2.1 β－catenin的表達(dá)及其與不同臨床病理特征之間的關(guān)系

β－catenin蛋白棕黃色顆粒定位于胞膜和胞質(zhì)。β－catenin在肺癌組織中的胞質(zhì)表達(dá)明顯高于對照組，差異具有顯著性（P＜0.05，表1，圖1）。肺癌組織中β－catenin的表達(dá)與患者性別和年齡、腫物大小之間的差異均無顯著性（P＞0.05），在 N1－2組和N0組肺癌組織中的表達(dá)差異亦無顯著性（P＞0.05）；但肺鱗癌組織中β－catenin的胞質(zhì)表達(dá)低于肺腺癌，胞膜表達(dá)高于肺腺癌，差異具有顯著性（P＜0.05，表2）。

表1 肺癌與正常對照組β－catenin和MMP－2胞質(zhì)表達(dá)的關(guān)系

圖1 A肺鱗癌組織中β－catenin的表達(dá) B肺腺癌組織中β－catenin的表達(dá) C對照組中β－catenin的表達(dá)（均×400）

2.2 MMP－2的表達(dá)及其與不同臨床病理特征之間的關(guān)系

MMP－2棕黃色顆粒主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)亦有不同程度的表達(dá)。和β－catenin一樣，MMP－2在肺癌組織中的胞質(zhì)表達(dá)明顯高于對照組，差異具有顯著性（表1，圖2）。在肺癌組織中，MMP－2的表達(dá)與患者性別和年齡、肺癌組織類型、腫物大小無關(guān)（P＞0.05）；但 N1－2肺癌組 MMP－2的表達(dá)明顯高于N0肺癌組，差異具有顯著性（P＜0.05，表3）。

表2 肺癌組織臨床病理特征與β－catenin表達(dá)的關(guān)系

圖2 D肺鱗癌組織中MMP－2的表達(dá) E肺腺癌組織中MMP－2的表達(dá) F對照組中MMP－2的表達(dá)（D、E×400，F(xiàn)×200）

表3 肺癌組織臨床病理特征與MMP－2胞質(zhì)表達(dá)的關(guān)系

2.3 肺癌組織中β－catenin與 MMP－2表達(dá)之間的關(guān)系

采用Spearman等級相關(guān)檢驗對肺癌組織中βcatenin與MMP－2表達(dá)之間的關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)二者不具有相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，表4）。

表4 肺癌組織中β－catenin與MMP－2表達(dá)之間的關(guān)系

3 討論

肺癌的發(fā)病機制復(fù)雜，是多因素參與、多階段發(fā)展的過程，其轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的復(fù)雜的、多步驟的連續(xù)過程［1］。在諸多相關(guān)基因中，β－catenin在細(xì)胞間黏附和細(xì)胞內(nèi)增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起雙重作用［2］，一方面，它在上皮鈣粘粘素—連環(huán)素復(fù)合體（E－cad－cat complex）中發(fā)揮橋梁作用，其一端與E－cadherin的細(xì)胞漿區(qū)結(jié)合，另一端與α－cadharin結(jié)合，而后者又與細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白骨架系統(tǒng)相連，從而構(gòu)成一套完整的細(xì)胞黏附系統(tǒng)，其主要功能是保持上皮組織的完整性，防止腫瘤細(xì)胞離散、脫落起重要作用。另一方面，β－catenin也是Wnt／β－catenin信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子［3］。當(dāng)Wnt信號存在時，Wnt蛋白與卷曲蛋白胞外區(qū)結(jié)合，在輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6協(xié)同作用下，胞質(zhì)中Dsh蛋白被募集至胞膜下，使糖原合酶激酶3β磷酸化失活并從軸蛋白上脫落，則βcatenin不能被降解，大量游離的β－catenin在胞質(zhì)中聚集并進入胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子／淋巴細(xì)胞增強因子結(jié)合，導(dǎo)致 Wnt靶基因（c－myc，cyclinD1等）的轉(zhuǎn)錄，繼而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和腫瘤的發(fā)生。

近年來，一系列研究證實，Wnt通路在腫瘤發(fā)生中起到重要作用，由于β－catenin在細(xì)胞黏附和增殖過程中的雙重作用，其表達(dá)異常對很多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的促進作用［4－7］。目前國內(nèi)外已有許多實驗［8－11］都表明肺癌組織中β－catenin異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分化、分期、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Retera等［10］的研究顯示，β－catenin的膜表達(dá)水平降低與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為具有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)后分子。最近由Xi－Qing Li等［12］報道的文獻中，顯示胞膜低表達(dá)β－catenin的肺癌患者生存率較正常表達(dá)者為低，且檢測β－catenin的胞質(zhì)或胞核的異位表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌具有重要臨床意義。βcatenin異常表達(dá)的原因很多，其中β－catenin基因外顯子3的突變是很多腫瘤中β－catenin異常蓄積的重要原因。β－catenin基因第三外顯子包含Ser29、Ser33、Ser37、Thr41、Ser45等突變熱點密碼子。這些密碼子編碼的絲（蘇）氨酸能夠直接被GSK－3β磷酸化，因此，這些位點的突變可影響βcatenin的降解，導(dǎo)致游離的β－catenin蓄積，引起細(xì)胞異常增殖。但是，徐洪濤［11］等對53例NSCLC標(biāo)本β－catenin基因第3外顯子進行了PCR擴增及測序，均未發(fā)現(xiàn)突變，證明β－catenin基因第3外顯子的突變在NSCLC中很少見。這些結(jié)果表明，在NSCLC中β－catenin基因第3外顯子的突變不是βcatenin異常表達(dá)的主要原因。β－catenin降解過程中任何異常都有可能造成β－catenin在胞質(zhì)中的蓄積。

本實驗研究結(jié)果表明，肺癌胞質(zhì)中β－catenin表達(dá)明顯高于對照組，這說明β－catenin作為Wnt信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，在胞質(zhì)中的異常表達(dá)可能對肺癌的發(fā)生具有促進作用。患者性別、年齡、腫物大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肺癌組織中β－catenin的表達(dá)無關(guān)，這與部分文獻描述一致［13］。但我們發(fā)現(xiàn)βcatenin在N1－2肺癌組和N0肺癌組中的表達(dá)差異無顯著性，與相關(guān)文獻描述不符［8－10］，不過 N1－2肺癌組有高胞質(zhì)表達(dá)和低胞膜表達(dá)的趨勢，其差異無顯著性是否與樣本量較少有關(guān)有待進一步研究。另外，肺鱗癌β－catenin的胞質(zhì)表達(dá)低于肺腺癌，胞膜表達(dá)高于肺腺癌。肺癌細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜中β－catenin的表達(dá)高低與腫瘤的分化程度及腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向有關(guān)，本研究中對肺腺癌及鱗癌未進行病理分化分級，并且未進行術(shù)后隨訪，因此其胞質(zhì)及胞膜表達(dá)差異是否與肺癌的組織學(xué)類型有關(guān)需要在進一步的研究中有待分析。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促進惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。許多疾病如骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、腫瘤等都伴隨著 MMPs活性的改變，其中以MMPs在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用最引人注目［14］。MMP－2（matrix metalloproteinase－2，基質(zhì)金屬蛋白酶－2）是所有MMPs中分布最廣的，當(dāng)細(xì)胞惡變時，常有 MMP－2的升高［15］，其主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白（主要是IV型膠原蛋白）促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［16］，許多實驗已經(jīng)證實 MMP－2在NSCLC 中 表 達(dá) 異 常［17－19］。 李 紅 梅 等［20］的 研 究 顯示，轉(zhuǎn)移能力相對較高的細(xì)胞系產(chǎn)生MMPs的能力強于轉(zhuǎn)移能力相對較低的細(xì)胞系。MMP－2通過對細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中Ⅳ型膠原的特異性降解，使腫瘤細(xì)胞浸潤能力增強，發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性增加。Suzuki等［21］用酶譜法和免疫組織化法在檢測NSCLC組織中MMP－2和MMP－9的表達(dá)水平，結(jié)果MMP－2較MMP－9有更強的表達(dá)，故認(rèn)為在肺癌中，MMP－2較MMP－9充當(dāng)更重要的角色。

本實驗證實，N1－2肺癌組 MMP－2的表達(dá)明顯高于N0肺癌組，亦即MMP2的表達(dá)與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，這與大多文獻報道相同［22］。此外，MMP－2的表達(dá)與患者性別和年齡、肺癌組織類型、腫物大小無顯著性差異也與文獻描述相同［23］。本實驗標(biāo)本量不多，隨訪中部分病例失訪，并且沒有到3年及5年隨訪時間，很難進行有效隨訪統(tǒng)計。我們將在隨后的大樣本實驗中做進一步完善。

我們還對肺癌組織中β－catenin胞質(zhì)表達(dá)和胞膜表達(dá)與MMP－2表達(dá)之間的關(guān)系分別進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，β－catenin胞質(zhì)表達(dá)和胞膜表達(dá)與MMP－2表達(dá)之間均無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），這一結(jié)果可能與本研究中肺鱗癌及肺腺癌組織樣本量較少有關(guān)，需要在后期研究中通過大樣本實驗來進一步證實。田素芳［24］等的研究顯示，胃腺癌組織中MMP－2的表達(dá)與β－catenin的膜表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與本實驗結(jié)果相矛盾。據(jù)文獻表述，β－catenin胞質(zhì)表達(dá)異常增強與腫瘤的發(fā)生和侵襲有關(guān)，但其胞膜表達(dá)下調(diào)與腫瘤淋巴結(jié)及遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未得到確證［25］。MMP－2的作用靶點主要是IV型膠原蛋白，而在正常細(xì)胞中，β－catenin則通過參與構(gòu)成上皮鈣粘素—連環(huán)素復(fù)合體（E－cad－cat complex）限制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP－2表達(dá)上調(diào)和β－catenin胞膜表達(dá)缺失可能協(xié)同參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，但二者之間的相關(guān)關(guān)系缺乏理論和實驗數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，β－catenin和 MMP－2在肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中均起到了不同程度的作用：βcatenin胞質(zhì)表達(dá)上調(diào)激活Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化，從而加速肺癌的發(fā)生和發(fā)展；MMP－2表達(dá)增強促進細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，因此提高了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。MMP－2表達(dá)上調(diào)和β－catenin胞膜表達(dá)下調(diào)可能協(xié)同參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，二者在肺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用是相加作用還是協(xié)同增強作用需要進一步研究及探討。

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