Frankia菌侵染木麻黃與其共生結(jié)瘤程序

張 昕，沈愛華，林永敬，王秋芹，林海萍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

木麻黃Casuarina spp.作為重要的共生營養(yǎng)型樹種，在防風(fēng)固沙、防海浪侵蝕以及海岸帶生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)中發(fā)揮重要的作用[1－2]。放線菌Frankia屬是木麻黃重要的共生固氮菌，因它在固定氮素、培肥地力、提高植物生長勢和土壤生態(tài)修復(fù)等方面的獨(dú)特優(yōu)勢，自從分離、獲得純培養(yǎng)以來一直是人們研究的目標(biāo)之一[3－5]。目前，F(xiàn)rankia菌的分離和純培養(yǎng)技術(shù)已較為成熟，并成功地建立起基因組提取和目標(biāo)基因擴(kuò)增的分子技術(shù)體系[6－8]。近年來結(jié)瘤基因和結(jié)瘤程序逐漸成為研究熱點(diǎn)。如Oureye等[9]將組培技術(shù)引入到Frankia菌結(jié)瘤的研究中，利用室內(nèi)組織培養(yǎng)研究了木麻黃在不同基質(zhì)培養(yǎng)基中的長勢和結(jié)瘤數(shù)量。McEwan[10]利用熒光顯微鏡觀察了Frankia菌侵染歐洲榿木Alnus glutinosa根部的早期過程。Liu等[11]利用超薄切片技術(shù)研究了Ceanothu spp.與Frankia菌的早期互作和侵染過程。張小民等[12]報道了Frankia菌-沙棘Hippophae rhamnoides共生體系的侵染和結(jié)瘤過程。但迄今為止關(guān)于自然條件下Frankia菌在木麻黃根部共生結(jié)瘤程序一直未有報道。浙江省島嶼星羅棋布，海岸線漫長，擁有豐富的木麻黃和Frankia菌資源。作者于2008－2010年就省內(nèi)豐富的木麻黃共生固氮Frankia菌進(jìn)行廣泛的收集，選取其中固氮效果較好的2株作為供試菌株，通過定期制作根瘤切片和顯微觀察還原了外界環(huán)境下Frankia菌在木麻黃根部的侵染、結(jié)瘤過程，以期為菌株的實際開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和苗木

供試2個Frankia菌株為作者2008－2010年分離自浙江省短枝木麻黃Casuarina equisetifolia上的根瘤，經(jīng)驗證具有良好的固氮活性，分別編號為 ZCN113和 ZCN192[13－14]。供試苗木為短枝木麻黃，購自浙江寧波永豐園林綠化公司，苗高15 cm。

1.2 回接結(jié)瘤

實驗于2011年3－6月在浙江農(nóng)林大學(xué)生物測試中心溫室內(nèi)進(jìn)行。把供試幼苗移栽至直徑20 cm的塑料營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽中混配體積比1∶1的沙土和基質(zhì)，澆水以使幼苗及時復(fù)壯，1周后待幼苗成功定植后用于后續(xù)試驗。供試2株Frankia菌株經(jīng)BAP培養(yǎng)基[15]28℃靜置培養(yǎng)4周后用于回接接種試驗。菌液離心后收集沉淀，輕微勻漿后以蒸餾水制備成菌懸液，用無菌注射器吸5 mL菌懸液注射到苗木根系周圍土壤，1株Frankia菌接60株苗，以無菌蒸餾水為對照，該試驗隔 20 d重復(fù)1次，共3次，以驗證其重復(fù)性。接種后隔3 d隨機(jī)選取木麻黃幼苗，以流水輕輕沖洗取其完整幼根觀察結(jié)瘤情況，并就結(jié)瘤部位、結(jié)瘤數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，將已產(chǎn)生的根瘤分別制作超薄和半薄切片，進(jìn)行電鏡和光鏡觀察。溫室環(huán)境控制為白天28℃，夜晚25℃，光周期14 h/10 h，空氣相對濕度70%。

1.3 顯微觀察

將上述根瘤用無菌去離子水沖洗干凈后切成大小為1.0 mm3的樣品，立即放入40.0 g·kg-1戊二醛固定液（用 0.2 mol·L－1磷酸緩沖液配制，pH 7.2）中 12 h，磷酸緩沖液清洗 3 次（20 min·次-1），再經(jīng) 20.0 g·kg-1餓酸固定4 h，然后用蒸餾水沖洗3次（20 min·次－1），用乙醇逐級脫水并用環(huán)氧丙烷過渡2次，然后用環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，切片厚度約90 nm，鉛鹽染色，JEM-1230型生物用透射電子顯微鏡觀察、攝影。半薄切片的制作是將包埋好的樣品切成0.6 μm半薄切片，在萬能顯微鏡下觀察拍片。

2 結(jié)果與分析

2.1 根部的結(jié)瘤情況

接種Frankia菌的木麻黃根部根毛與未接菌的對照相比未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的變化。接種24 d后，根部開始出現(xiàn)近球形根瘤，根瘤較小，隨著時間延長，根瘤逐漸增大、數(shù)量逐步增加，到45 d左右根瘤數(shù)目達(dá)到最大，并不再增加。此時整個根系的根瘤大小不一，較大根瘤直徑為4 mm，小的1 mm左右。根瘤主要集中在由主根發(fā)起的新鮮、細(xì)小側(cè)根上。側(cè)根呈毛發(fā)狀，多在毛發(fā)狀的側(cè)根中間形成根瘤，初期根瘤極小，在側(cè)根中央略突起，逐漸成近球形，透明，后隨著根瘤長大，逐漸成白色根瘤，接著顏色加深，略呈褐色。此外，根部的根瘤常可聚集生長，使得結(jié)瘤處根部呈念珠狀，少數(shù)在端部產(chǎn)生根瘤，使得根端部呈球形，或者明顯加粗，根瘤表面光滑，與其他部位相比根毛稀少，如圖1。

2.2 Frankia菌的侵染過程

圖1 木麻黃根瘤 （A：早期幼嫩根瘤；B：呈念珠狀根瘤）Figure1 Root nodules produced by Casuarina equisetifolia（A：baby nodules；B：bead-shape nodules）

圖2 接種6 d后根組織縱截面超薄切片（黑色為侵染細(xì)胞）400×Figure2 Longitudinal section of root of Casuarina equisetifolia 6 d after inoculation（the darken cells were infected，400×）

接種3 d后，不同菌株接種的木麻黃根部細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)都沒有發(fā)生改變。接種6 d后，光學(xué)顯微鏡觀察顯示Frankia菌已開始侵染根部細(xì)胞（圖2），被侵染的根毛代謝十分活躍，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的核糖體、高爾基體、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管等以及酚類物質(zhì)，并被侵染的根毛發(fā)生了代謝方向上的改變，從侵染位點(diǎn)2側(cè)可以看到,根毛初生壁內(nèi)側(cè)迅速增厚，形成了很多不規(guī)則的電子密度中等的沉積物（圖3）。在電鏡切片上可以明顯看到，由于內(nèi)生壁的局部加厚而形成一個管狀結(jié)構(gòu)，這個管狀結(jié)構(gòu)將菌體包裹起來，形成 “侵染線”。隨著菌體在侵染線內(nèi)的繼續(xù)侵入，在菌體黏液層外很快又被這些新形成的沉積物所包裹，這些沉積物形成了菌體最外層新的保護(hù)結(jié)構(gòu)，而且隨菌體繼續(xù)侵染，沉積物在菌體外進(jìn)一步加厚。這層菌體外的特殊保護(hù)結(jié)構(gòu)，就是 “界面質(zhì)”（interfacial matrix，圖4）。當(dāng)侵染菌體接觸并進(jìn)入根毛皮層細(xì)胞前，侵染線前方的皮層細(xì)胞早已開始膨大，轉(zhuǎn)變?yōu)閭鬟f細(xì)胞。傳遞細(xì)胞極度增大，并在侵染點(diǎn)2側(cè)細(xì)胞內(nèi)壁增生，沉積物增多（圖6）。接種12 d后從透射電鏡切片還可以看到，中柱形成層細(xì)胞形成了根瘤原基。15 d后根瘤原基部分薄壁細(xì)胞被Frankia菌侵染后，轉(zhuǎn)變?yōu)榍案觯▓D7），薄壁細(xì)胞中可見明顯的菌絲、泡囊和孢子（圖8）。前根瘤進(jìn)一步生長發(fā)育伸長，突出皮層后形成新根瘤并最終發(fā)育成成熟瘤（接種24 d后）。Frankia菌整個侵染過程可總結(jié)為：Frankia菌侵染→侵染線→形成“界面質(zhì)”→穿壁→繁殖→泡囊→孢子。根瘤中的整個生活史為：根瘤原基→前根瘤→成熟瘤。且在根瘤由小及大的過程中，切片組織發(fā)現(xiàn)木麻黃根系細(xì)胞壁出現(xiàn)沉積物，且有逐步增多的趨勢，細(xì)胞壁隨之加厚（圖 9）。

圖3 Frankia菌侵入根毛后，根毛細(xì)胞內(nèi)形成大量不規(guī)則、電子密度中等的沉積物（3000×）Figure3 Roothaircellsproducedabundant irregular electron dense deposit afterinfectedbyFrankia（3000×）

圖4 菌體外的特殊保護(hù)結(jié)構(gòu)——“界面質(zhì)”（20000×）Figure4 Especial protection structure：“interfacial matrix” packaging Frankia strains（20000×）

圖5 根毛細(xì)胞內(nèi)大量的線粒體及菌體的孢子Figure5 Abundant mitochondrias and Frankia spores in root hair cells

圖6 體積增大，沉積物增多的傳遞細(xì)胞Figure6 Enlarging transfer cells with more deposit

圖7 已被Frankia菌侵染的前根瘤（接種15 d后，100×）Figure 7 Prenodule infected by Frankia 15 d after inoculation（100×）

圖8 根瘤細(xì)胞內(nèi)Frankia菌的菌絲和泡囊 （圖中白色圓形區(qū)域，20000×）Figure8 Hypha and vesicles of Frankia inside nodule cell 20000×）

圖9 隨著Frankia菌侵入根系細(xì)胞壁出現(xiàn)沉積物并有加厚趨勢 （A：早期細(xì)胞壁；B：中期細(xì)胞壁；C：晚期細(xì)胞壁，4000×）Figure9 Cell wall exhibited pigementation and becoming thickening with the proceeding intracellularly of Frankia （A∶early cell wall；B：interim cell wall；C：terminal cell wall，4000×）

3 討論

Frankia菌與木本植物共生結(jié)瘤后產(chǎn)生裂瓣狀根瘤，有時數(shù)個根瘤同時發(fā)生，從而最終形成成熟的瘤簇。在本研究中木麻黃形成的根瘤均為圓形，根瘤較小，有時呈串珠狀，結(jié)果證實了土質(zhì)不同形成的根瘤的形態(tài)和數(shù)量不同的報道。例如，劉強(qiáng)等[16]發(fā)現(xiàn)土壤的比重、容量、孔隙影響木麻黃的結(jié)瘤數(shù)量、分布和形態(tài)。土壤顆粒越細(xì)、質(zhì)地越硬，孔隙就越小，通氣性就越差，根系難以延伸，不利于根瘤形成且根瘤較小。在本實驗中因混配了大量的沙土，最終多數(shù)根瘤產(chǎn)生在土壤 5～10 cm的土層中，且呈串珠狀，個體小，數(shù)量多，2個菌株表現(xiàn)出一致性。研究還發(fā)現(xiàn)，根瘤產(chǎn)生的時間不具有同一性，第1個真正根瘤產(chǎn)生于接種后第24天，在第36天的追蹤取樣時發(fā)現(xiàn)，同一根系出現(xiàn)發(fā)育程度不同的根瘤，且新出現(xiàn)根瘤多數(shù)出現(xiàn)在幼嫩新發(fā)出側(cè)根上。可推斷，利用土壤根圈接種，與Frankia菌最先接觸的根系最易早期發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)繼而結(jié)瘤，而后，新產(chǎn)生的根系在延伸的過程中與存在于土壤中的菌絲再行接觸形成次期根瘤。此外，本實驗中在盆缽的固定空間根瘤到達(dá)一定數(shù)量后不再增加，或增加緩慢。原因可能是根瘤數(shù)目在一定空間達(dá)到飽和，或者所產(chǎn)生根瘤已幫助宿主獲得足夠氮源從而抑制了新的根瘤產(chǎn)生。

Frankia菌侵染木麻黃是從根毛開始的，通過化學(xué)的信號傳導(dǎo)造成根毛變形然后進(jìn)入表皮和皮層細(xì)胞[17-19]。但在本研究中，因木麻黃產(chǎn)生的根毛稀少且在根表生長不連續(xù)，未觀察到有明顯的根毛變形現(xiàn)象，究其原因也可能是本研究以3 d為固定時間間隔取樣錯過根毛變形觀察的最佳時期。Valverde和Wall[20]也通過定期制作超薄切片對Frankia-Discaria trinervis的結(jié)瘤進(jìn)行了監(jiān)測，但其結(jié)瘤的進(jìn)程提前于我們的研究結(jié)果。這或許暗示Frankia菌與不同的寄主結(jié)瘤的時間程序不同，除了寄主的因素外，菌株的結(jié)瘤特性，土壤的質(zhì)地、肥力條件可能都將是影響結(jié)瘤進(jìn)程的因素，有待進(jìn)一步研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在Frankia菌還在木麻黃根部皮層細(xì)胞侵染繁殖時，內(nèi)部中柱鞘就受到刺激開始定向地快速分裂，最終形成根瘤原基，與前人的研究具有一致性。據(jù)此可推測，在Frankia菌與宿主的共生關(guān)系中存在著某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但至今對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制沒有相關(guān)報道，這將是Frankia菌結(jié)瘤的另一研究熱點(diǎn)。

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