超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量

周貽兵，吳 坤，劉利亞，王婭芳，李 磊，林 野

（1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018）

孔雀石綠（malachite green，MG）和結(jié)晶紫（crystal violet，CV）均屬于堿性三苯甲烷類染料。MG與CV能夠阻礙蛋白肽的形成，抑制細(xì)胞分裂，從而產(chǎn)生良好的抗菌和殺菌作用，因殺菌效果較好、價(jià)廉、易得等優(yōu)點(diǎn)，作為化學(xué)消毒劑曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治。魚暴露在含有MG或CV的水中，MG和CV會迅速被魚類吸附且富集在肌肉中，并在組織中很快代謝為危害性更強(qiáng)的隱色孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）和隱色結(jié)晶紫（leucocrystal violet，LCV），而代謝物在肌肉組織中的殘留時(shí)間較長。MG和CV及其代謝物具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點(diǎn)［1－7］。歐美、日本等國家已宣布嚴(yán)禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用孔雀石綠和結(jié)晶紫，并規(guī)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫不得檢出。2002年5月我國農(nóng)業(yè)部將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動(dòng)物，但非法使用屢禁不止。

目前，魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的測定方法有高效液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜法、高效液相色譜－質(zhì)譜法、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法、共振瑞利散射法、薄層色譜法、分光光度法等［8－12］。氣相色譜－質(zhì)譜法僅能測定隱性孔雀石綠；液相色譜－質(zhì)譜法需要特殊的柱后衍生設(shè)備，可能會引起峰展寬、降低靈敏度，同時(shí)衍生化試劑也可能對分離造成干擾；薄層色譜法、分光光度法等操作過程繁瑣，易造成假陽性。魚樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜，易造成基質(zhì)抑制效應(yīng)，可通過穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和選擇較優(yōu)的樣品凈化技術(shù)來解決。本研究在樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）法同時(shí)測定魚樣品中 MG、LMG、CV、LCV殘留，并對大批次魚樣的肌肉組織進(jìn)行檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000超高壓液相色譜儀，TSQ Quantum ultra三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Thermo－Fisher世爾科技有限公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）；Sigma臺式高速離心機(jī)；TTL－DCⅡ型氮吹儀；艾科浦超純水機(jī)；中性氧化鋁固相萃取小柱（6mL／1g）。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（100mg／L）：購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研所；結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.9%）、隱色結(jié)晶紫（純度＞99.7%）：購自中國計(jì)量科學(xué)研究院；D5－孔雀石綠苦味酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品和D5－隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.7%）：購自Sigma公司；醋酸銨（分析純），乙腈（色譜純），甲酸（色譜純）：購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取適量的結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、D5－隱色孔雀石綠和D5－孔雀石綠苦味酸（折算成D5－孔雀石綠）標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1 000mg／L標(biāo)準(zhǔn)貯備液；將標(biāo)準(zhǔn)貯備液（CV、LCV、D5－MG、D5－LMG）和 MG、LMG（100mg／L）用乙腈稀釋成10mg／L標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液；分別取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液，用乙腈稀釋成100μg／L標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品的制備與提取 從市場上購買不同品種的活魚，經(jīng)剖殺去除頭、骨、內(nèi)臟，將肉切成塊狀，用電動(dòng)絞肉機(jī)打成漿狀，于－20℃保存，待測。

將魚樣解凍，準(zhǔn)確稱取5g（精確到0.1g）均勻樣品于50mL塑料離心管中，添加100μL混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液，加入25mL乙腈，旋渦混勻器上混勻，以10 000r／min離心10min，收集上清液于玻璃管中，待凈化。

1.2.2 樣品凈化 用5mL乙腈活化中性氧化鋁小柱，取5mL上清液于中性氧化鋁小柱上，用10mL玻璃試管收集濾液，再用5mL乙腈淋洗小柱，將收集的濾液和淋洗液混合，40℃下氮吹至近干，用V（乙腈）∶V（5mmol／L醋酸銨）＝50∶50的溶液溶解殘?jiān)^0.22μm濾膜，液質(zhì)聯(lián)用儀檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil Gold－C18柱（150mm×2.1mm×1.9μm）；柱溫30℃；進(jìn)樣體積10μL；流動(dòng)相：5mmol／L乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH 4.5）和乙腈；流速0.4mL／min；梯度洗脫條件列于表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 ESI（＋）離子源，噴霧電壓3 000V，毛細(xì)管溫度350℃，蒸發(fā)溫度450℃，鞘氣壓力276kPa，輔助氣壓力104kPa，碰撞氣（Ar）壓力0.2Pa，SRM 優(yōu)化參數(shù)列于表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 提取與凈化

MG、CV在魚肌肉組織中很快代謝為LMG、LCV，隱色代謝物具有很好的親脂性，魚肌肉樣品基質(zhì)化學(xué)成分復(fù)雜，其中脂肪的存在不利于目標(biāo)物的提取與凈化，在測定過程中易產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，所以應(yīng)設(shè)法去除脂肪以提高離子化效率和儀器的靈敏度。去除樣品中的脂肪常用氧化鋁（酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁）［13－14］，在非極性溶劑乙腈中，用乙腈活化過的酸性氧化鋁和中性氧化鋁對目標(biāo)化合物的吸附能力很弱，而堿性氧化鋁對MG有一定的吸附，所以本實(shí)驗(yàn)選擇的中性氧化鋁能有效的去除脂肪且減少目標(biāo)化合物的吸附。在樣品提取和凈化過程中，微量的LMG、LCV被氧化為MG、CV，文獻(xiàn)報(bào)道［15］加入還原能力更強(qiáng)的物質(zhì)能有效防止這種情況的發(fā)生，而本實(shí)驗(yàn)則采用加入穩(wěn)定性同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)來提高測定的準(zhǔn)確性。

2.2 LC－MS／MS分析

通過ESI正離子模式對4種目標(biāo)化合物及2種內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)行全掃描，找出準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］，并且以此準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行轟擊和二級質(zhì)譜掃描，找出2個(gè)信號較強(qiáng)的碎片離子構(gòu)成監(jiān)測離子對（表2）。結(jié)晶紫碎片離子的質(zhì)譜圖示于圖1，可以看出，結(jié)晶紫m／z340和356兩個(gè)碎片離子的響應(yīng)信號較強(qiáng)，以這兩個(gè)碎片離子和準(zhǔn)分子離子峰構(gòu)成監(jiān)測離子對。改變透鏡電壓使母離子最大效率的通過一級質(zhì)譜進(jìn)入二級質(zhì)譜進(jìn)行碰撞，對碎片離子的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，提高碎片離子的響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)晶紫準(zhǔn)分子離子透鏡電壓優(yōu)化曲線和碎片離子碰撞能量優(yōu)化曲線示于圖2。

在流動(dòng)相中加入適量的甲酸、乙酸和低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽在離子化過程中得到更加豐富的離子碎片信息，改善峰形，提高測定的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相水中加入5mmol／L醋酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)pH 4.5，獲得良好的效果。以SRM模式對待測物進(jìn)行定性定量分析，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM圖示于圖3。

圖1 結(jié)晶紫準(zhǔn)分子離子（a）和碎片離子（b）質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrometer of quasi－molecular（a）and fragment（b）ions of CV

圖2 結(jié)晶紫準(zhǔn)分子離子透鏡電壓（a）和碎片離子碰撞能量優(yōu)化曲線（b）Fig.2 Optimizing curves of quasi－molecular ion tube lens（a）and fragment ion collision energy（b）of CV

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of extract in mixed standard solution

2.3 工作曲線和檢出限

取100μg／L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用V（乙腈）∶V（5mmol／L醋酸銨）＝50∶50的溶液配制成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg／L系列濃度溶液，其中內(nèi)標(biāo)含量均為2.0μg／L，按1.3進(jìn)行測定。分別用 MG、CV的峰面積與D5－MG的峰面積比值和LMG、LCV的峰面積與D5－LMG的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。MG：y＝0.219 7x－0.011 1（r2＝0.999 1）；CV：y＝0.245 7x－0.006 4（r2＝0.999 6）；LMG：y＝0.443 7x－0.011 4（r2＝0.999 6）；LCV：y＝0.083 8x＋0.004 1（r2＝0.999 3）。以各目標(biāo)物在空白樣品中的S／N＝3計(jì)算該方法的檢出限，MG、LMG、CV 檢出限為 0.01 μg／kg，LCV檢出限為0.06μg／kg。

2.4 方法的回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

在空白樣品中分別添加0.25、2.0μg／kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.0μg／kg內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻，放置過夜吸收，按1.2方法提取、凈化、上機(jī)測定，回收率及精密度列于表3。

表3 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Table 3 The results of recoveries and precision

2.5 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用此方法檢測市售的109批魚樣品，其中孔雀石綠陽性樣品1份，含量為0.57μg／kg；隱色孔雀石綠陽性樣品15份，含量在0.65～10.6 μg／kg之間；結(jié)晶紫陽性樣品5份，含量在0.56～1.19μg／kg之間；隱性結(jié)晶紫陽性樣品1份，含量為0.65μg／kg。結(jié)果表明，市售的魚樣品中仍然存在濫用孔雀石綠和結(jié)晶紫的情況。

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC－MS／MS測定魚樣品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的方法。樣品中MG、CV及其代謝物直接用乙腈提取，簡化了樣品前處理步驟，同時(shí)加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，降低基質(zhì)抑制效應(yīng)。在空白樣品中加入兩個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率、精密度良好，檢出限低。該方法能夠靈敏、準(zhǔn)確、可靠的測定魚中MG、CV及其代謝物殘留，為魚類水產(chǎn)品養(yǎng)殖、流通和使用環(huán)節(jié)的市場監(jiān)管提供參考依據(jù)。

［1］ CULP S J，BELAND F A.Malachite green：A toxicological review ［J］.International Journal of Toxicology，1996，15：219－238.

［2］ 劉 軍，胡華軍，張明洲，等.魚藥孔雀石綠的毒性、危害和檢測現(xiàn)狀［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18（5）：397－340.LIU Jun，HU Huajun，ZHANG Mingzhou，et al.Review on toxicity，damage and detection of fishing drug－malachite green［J］.Acta Agriculturae Zhangjiang Gensis，2006，18（5）：397－340（in Chinese）.

［3］ 李永生，劉艷輝.禁用藥物孔雀石綠的毒性、危害及控制措施［J］.吉林水利，2010，30（5）：100－102.LI Yongsheng，LIU Yanhui.The toxicity of prohibited of malachite green，hazards and control measures［J］.Jilin Water Resources，2010，30（5）：100－102（in Chinese）.

［4］ 翟毓秀，郭瑩瑩，耿 霞，等.孔雀石綠的代謝機(jī)理及生物毒性研究進(jìn)展［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，37（1）：27－32.ZHAI Yuxiu，GUO Yingying，GENG Xia，et al.Advances in studies on metabolic mechanism and bio－toxicity of malachite green［J］.Periodical of Ocean University of China，2007，37（1）：27－32（in Chinese）.

［5］ ANDERSEN W C，ROYBAL J E，TURNIPSEED S B.Liquid chromatographic determination of malachite green and leucomalachite green（LMG）residues in salmon with in situ LMG Oxidation［J］.Journal of AOAC International，2005，88：1 292－1 298.

［6］ LEE K C，WU J L，CAI Z G.Determination of malachite green and leucomalachite green in edible goldfish muscle by liquid chromatography－ion trap mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2006，843（2）：247－251.

［7］ WU X L，ZHANG G，WU Y N，et al.Simultaneous determination of malachite green，gentian violet and their leucometabolites in aquatic products by high－performance liquid chromatographylinear ion trap mass spectrometry［J］.J Chromatography A，2007，1 172（2）：121－126.

［8］ BERGWERFF A A，SCHERPENISSE P.Determination of residues of malachite green in aquatic animals［J］.Journal of Chromatography B，2003，788（2）：351－359.

［9］ 朱寬正，王 鵬，林雁飛，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫以及它們的隱色代謝物殘留［J］.色譜，2007，25（1）：66－69.ZHU Kuanzheng，WANG Peng，LIN Yanfei，et al.Simultaneous determination of residues of malachite green，crystal violet and their leuco metabolites in aquatic products by liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Chromatography，2007，25（1）：66－69 （in Chinese）.

［10］ 謝 文，丁慧瑛，奚君陽，等.水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物殘留量的檢測［J］.色譜，2006，24（5）：529－530.XIE Wen，DING Huiying，XI Junyang，et al.Determination of residual amounts of malachite green crystal violet and their lucobases in aquatic products［J］.Chinese Journal of Chromatography，2006，24（5）：529－530（in Chinese）.

［11］ 高華鵬，李永夫，沈維軍，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量［J］.理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊，2008，44（2）：103－106.GAO Huapeng，LI Yongfu，SHEN Weijun，et al.HPLC－MS／MS determination of residual amounts of malachite green crystal violet and their lucobases in eel［J］.Physical Testing and Chemical Analysis Part B：Chemical Analysis，2008，44（2）：103－106（in Chinese）.

［12］ 張玉黔，權(quán)伍英，欒 燕，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠的方法研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（7）：826－827.ZHANG Yuqian，QUAN Wuying，LUAN Yan，et al.Determination of viola crystallina，leucoviola crystallina and their metabolites contents in aquatic products by HPLC－MS／MS methods［J］.Chinese Journal Health Laboratory Technology，2006，16（7）：826－827（in Chinese）.

［13］ RUSHING L G，THOMPSON Jr H C.Simultaneous determination of malachite green，gentian violet and their leucometabolites in cat fish or trout tissue by high－performance liquid chromatography with visible detection［J］.Journal of Chromatography B，1997，688：325－330.

［14］ 郭德華，葉長淋，朱瑩潔.液相色譜法測定鰻魚中的孔雀石綠［J］.化學(xué)計(jì)量分析，2002，11（2）：20－21.GUO Dehua，YE Changlin，ZHU Yingjie.Determination of malachite green in the eel by liquid chromatography［J］.Chemical Analysis and Meterage，2002，11（2）：20－21（in Chinese）.

［15］ 江 潔，林 洪，徐 杰.孔雀石綠及無色孔雀石綠的固相萃取性能比較［J］.理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊，2008，44（10）：965－967.JIANG Jie，LIN Hong，XU Jie.Study of extraction behavior of solid phase extraction materials for malachite green and leucomalachite green［J］.Physical Testing and Chemical Analysis Part B：Chemical Analysis，2008，44（10）：965－967（in Chinese）.