LC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定口炎清顆粒中8種成分

張子建， 孫冬曉， 王 婧， 董立華， 郭盼盼， 王春英*

（1.河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊050011；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊050017；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，河北石家莊 050031）

LC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定口炎清顆粒中8種成分

張子建1， 孫冬曉2， 王 婧3， 董立華2， 郭盼盼2， 王春英2*

（1.河北省中醫(yī)院口腔科，河北 石家莊050011；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊050017；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，河北石家莊 050031）

目的 建立用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定口炎清顆粒 （天冬、麥冬、玄參、山銀花、甘草）中8種成分的方法。方法 采用C18色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫。采用混合線性離子肼，電噴霧離子源，多反應(yīng)離子檢測(cè)和負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，對(duì)口炎清顆粒中哈巴苷、甘草苷、綠原酸、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元、菝契皂苷元等8種化學(xué)成分進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果 所有被測(cè)物的線性關(guān)系良好 （r＞0.999）；方法回收率為100.5%～107.6%，RSD為1.3%～3.2%。結(jié)論 此方法準(zhǔn)確，快速，重復(fù)性好，有望為口炎清顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

口炎清顆粒；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；質(zhì)量控制

口炎清顆粒是由天冬，麥冬，玄參，山銀花和甘草五味中藥組成的復(fù)方制劑，具有滋陰清熱，解毒消腫之功效，用于治療陰虛火旺所致的口腔疾?。?-3］。目前，對(duì)于該制劑的質(zhì)量控制主要是以綠原酸為指標(biāo)成分的高效液相色譜法［1，4-5］。雖有文獻(xiàn)對(duì)口炎清顆粒的指紋圖譜進(jìn)行了研究，并對(duì)一些色譜峰進(jìn)行了歸屬研究，但缺乏定量數(shù)據(jù)，并且由于采用的是高效液相色譜法，分析周期長(zhǎng)達(dá)2 h［6］。液質(zhì)聯(lián)用 （LC-MS/MS）技術(shù)具有專(zhuān)屬性好，靈敏度高和快速高效的特點(diǎn)，已逐漸成為中藥成分定量分析的有效方法［7-8］。本研究采用混合線性離子肼，電噴霧離子源，多反應(yīng)離子檢測(cè)和負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，同時(shí)測(cè)定口炎清顆粒中哈巴苷、甘草苷、綠原酸、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元8種成分，為口炎清顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

3200 Q-Trap型串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，Analyst 1.4.2分析軟件 （美國(guó)AB公司）；Agilent 1200液相色譜儀，包括G1311A型四元梯度洗脫泵，G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器和G1322A型在線脫氣儀（美國(guó) Agilent公司）。口炎清顆粒 （規(guī)格：10 g/袋，批號(hào)為 C1A028，D2A012，C2A020，廠家為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司）。菝契皂苷元、魯斯可皂苷元、哈巴苷和甘草酸對(duì)照品 （南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司），肉桂酸和綠原酸對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院），甘草苷和甘草次酸對(duì)照品 （上海寶曼生物科技有限公司），所有對(duì)照品純度均大于98%。甲醇 （色譜純，F(xiàn)isher公司），甲酸及其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇 （A）-水 （B），梯度洗脫 （A∶B為0～4 min，20∶80～60∶40；4～6 min，60 ∶40～95 ∶5；6～14 min，95 ∶5；14～14.1 min，95∶5～20∶80）；柱溫 35℃；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，采用負(fù)離子模式掃描，源噴射電壓－4 500/5 500 V；溫度650℃；氣簾氣 25 psi（1 psi=6.895 kPa）；霧化氣60 psi，輔助氣 65 psi。8種被測(cè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、二級(jí)譜圖、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、出峰時(shí)間、解簇電壓和碰撞電壓見(jiàn)圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取8種對(duì)照品適量，各置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取各貯備液適量，置10 mL量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，得各化合物的混合對(duì)照品溶液。對(duì)照品溶液的色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取顆粒劑細(xì)粉約2.5 g，加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，冷至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得。供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 線性關(guān)系與定量限 精密量取混合對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇定量稀釋制得系列質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 口炎清顆粒中8種被測(cè)成分的回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍及最低定量限Tab.1 Regression equation，correlation coefficient and quantitation limits of the 8 components in Kouyanqing Granules

2.5 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算哈巴苷、綠原酸、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元峰面積的 RSD分別為2.5%、1.4%、0.9%、3.1%、1.5%、1.8%、2.1%、3.2%。表明該方法具有較好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8和12 h，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算哈巴苷、綠原酸、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元峰面積的RSD 分 別 為 2.7%、2.1%、1.2%、2.4%、1.6%、1.4%、1.7%、2.5%，表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的供試品細(xì)粉6份，按2.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算哈巴苷、綠原酸、甘草苷、肉桂酸、甘草酸、甘草次酸、魯斯可皂苷元和菝契皂苷元含有量的RSD分別為1.6%、2.4%、1.8%、3.1%、0.8%、1.7%、2.5%、2.9%，表明該方法的重復(fù)性良好。

圖1 口炎清顆粒中8種被測(cè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、二級(jí)質(zhì)譜圖、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、出峰時(shí)間、解簇電壓和碰撞電壓Fig.1 Chemical structures，the product ion spectra，MS/MS fragment ions，declustering potential（DP）and collision energy（CE）of the 8 components in Kouyanqing Granules

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)已知含有量的供試品細(xì)粉6份，每份1.25 g，分別精密加入各被測(cè)組分以50%甲醇為溶解的混合對(duì)照品貯備液10 mL，及50%甲醇40 mL，按2.3.2項(xiàng)下的方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 對(duì)照品溶液 （A）和供試品溶液 （B）的總離子流色譜圖 （a）和提取離子色譜圖Fig.2 Total ionschromatograms（a）and extract ions chromatograms of standard solution（A）and sample solution（B）

2.10 樣品測(cè)定 取口炎清顆粒3批，分別按2.3.2項(xiàng)下的方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 測(cè)定成分的選擇 口炎清顆粒由五味中藥組成，《中國(guó)藥典》及其他文獻(xiàn)報(bào)道只選擇了山銀花中的綠原酸為定量指標(biāo)成分。本試驗(yàn)從每味中藥中選擇1～3個(gè)主要化學(xué)成分為測(cè)定指標(biāo)，具體如下：天冬中的菝契皂苷元［9］；麥冬中的魯斯可皂苷元［10］；山銀花中綠原酸［11］；玄參中的哈巴苷和肉桂酸［12］；甘草中的甘草苷、甘草酸和甘草次酸［3］。由于此方法能夠兼顧到制劑組方中的每一味藥，故能較全面的控制該制劑的質(zhì)量。

表2 口炎清顆粒中8種被測(cè)成分的回收率 （n=6）Tab.2 Recoveries of 8 components in Kouyanqing Granules（n=6）

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Results of sample analysis（n=3）

3.2 綠原酸的定量 在對(duì)綠原酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)論是選擇m/z353.1→191.0，還是其他離子對(duì)，在其對(duì)照品和樣品色譜圖上均出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［14］，因?yàn)榫G原酸的分子結(jié)構(gòu)中存在雙鍵結(jié)構(gòu)，其在水溶液以順?lè)磧煞N異構(gòu)體的形式存在，并且互相轉(zhuǎn)化，直至達(dá)到平衡。因此在定量時(shí)應(yīng)按兩色譜峰之和計(jì)算。

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Simultaneous determination of eight components in Kouyanqing Granules by LC-MS/MS

ZHANG Zi-jian1， SUN Dong-xiao2， WANG Jing3， DONG Li-hua2， GUO Pan-pan2， WANG Chun-ying2*
（1.Department of Stomatology，Hebei Provincial TCM Hospital，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Pharmacy，The First Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China）

AIMTo establish a LC-MS/MS method for simultaneously determining eight components in Kouyanqing Granules（Asparagi Radix，Ophiopogonis Radix，Scrophulariae Radix，Lonicerae Flos，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）.METHODSA C18column was used with the mobile phase of methanol-water（containing 0.5 mmol/L ammonium acetate and 0.1%formic acid）in gradient elution mode.Analytes（harpagide，liquiritin，chlorogenic acid，cinnamic acid，glycyrrhizic acid，glycyrrhetinic acid，ruscogenin and sarsasapogenin）were detected using a hybrid quadrupole linear ion trap mass spectrometer that was equipped with an electrospray ionization source operating in the negative and multiple-reaction monitoring（MRM）modes.RESULTSAll the components showed good linearity（r＞0.999）.Their recoveries were 100.5% －107.6%with RSDs of 1.3%-3.2%.CONCLUSIONThe developed method is accurate，sensitive，rapid and suitable for the quality control of Kouyanqing Granules.

Kouyanqing Granules；LC-MS/MS；quality control

R927.2

A

1001-1528（2013）05-0952-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.020

2012-12-26

河北省自然基金-石藥集團(tuán)醫(yī)藥聯(lián)合研究基金資助項(xiàng)目 （C2011206170）；河北省教育廳自然科學(xué)指令性課題 （2009147）

張子建 （1972—），男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔醫(yī)學(xué)研究。Tel：（0311）66792669，E-mail：zjzh3@163.com

*通信作者：王春英 （1972—），女，博士，副教授，主要從事中藥質(zhì)量控制和體內(nèi)過(guò)程研究。Tel：（0311）86265625，E-mail：wangcy730301@163.com