T-bet、GATA-3、FoxP3 及 CDCD調節(jié)性T細胞在AA發(fā)病機制中的作用

沈紅石，陳海飛，任傳路，李征洋，唐杰慶，王 靜，吳天勤

(中國人民解放軍第100醫(yī)院，江蘇蘇州215007)

再生障礙性貧血(AA)是一種以全血細胞減少與骨髓造血功能衰竭為特征的骨髓造血系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機制尚不十分清楚，免疫介導的造血抑制是AA最常見、目前研究最多的發(fā)病機制。已有研究表明，AA發(fā)生造血功能衰竭與細胞免疫功能異常、大量寡克隆淋巴細胞及/或自然殺傷細胞局部浸潤、多種細胞因子分泌失調及造血微環(huán)境受損等因素有關［1～3］，因此進一步了解AA的免疫發(fā)病機制對AA的臨床診斷及治療等方面有著重要的意義。T-bet、GATA-3分別為Th1、Th2細胞特異性的轉錄因子，F(xiàn)oxP3為調節(jié)性T細胞特異性的轉錄因子。本研究通過檢測AA患者外周血單個核細胞(PBMC)中轉錄因子 T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA的表達、血漿中Th1類細胞因子IFN-γ和Th2類細胞因子IL-4水平及AA患者外周血調節(jié)性T細胞水平，從轉錄因子水平為AA的臨床診斷和治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2011年5月我院血液科門診就診及病房中的患者27例(AA組)，其臨床骨髓細胞形態(tài)學、生化及細胞遺傳學檢查符合AA診斷標準［4］。其中男17例、女10例，年齡19～58(33±9.8)歲，病程5～235(20±17.6)個月。對照組選擇健康體檢者25例，其中男16例、女9例，年齡20～59(32±8.3)歲。

1.2 標本采集 AA組與對照組均抽取外周靜脈血8 mL，其中EDTA抗凝6 mL，肝素鈉抗凝2 mL。后者經培養(yǎng)16～20 h后用于T細胞亞群的檢測。EDTA抗凝外周血6 mL分離PBMC，提取總mRNA，-80℃低溫凍存?zhèn)溆谩Ｓ糜?T-bet、GATA-3和FoxP3的測定。

1.3 檢測方法

1.3.1 T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA的檢測 通過實時熒光定量PCR方法檢測這3種轉錄因子水平。TRIzol、FQPCR試劑盒均購自美國 Gibco-BRL，ABI7300型Real Time PCR檢測儀購自美國公司。通過美國生物技術中心GeneBank數(shù)據(jù)庫檢索T-bet、GATA-3、FoxP3、GAPDH mRNA 序列，利用美國Whitehead生物醫(yī)學研究所Primer3程序設計探針，參考文獻方法設計上下游引物，由上海申友生物技術有限公司合成。探針及引物序列見表1。實時定量FQ-PCR總反應體系25 μL，其中含2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，樣品 cDNA 1.5 μL。反應條件:50 ℃2min，95 ℃15min;94 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，50次循環(huán)。采用RG-3000實時監(jiān)測定量RT-PCR儀。利用溶解曲線進行產物的特異性分析，采用Relative Quantification Software 1.0分析軟件進行分析，結果判斷以同時擴增的內參照GAPDH的表達強度為基準，表達強度以轉錄因子/GAPDH的基因拷貝數(shù)的比值來表示。

表1 T-bet、GATA-3、FoxP3及GAPDH探針及引物序列

1.3.2 T細胞亞群的檢測 抗體有FITC標記的鼠抗人 CD4、CD25、CD3抗體，PE 標記的 CD25，同型對照抗體為PE標記的鼠抗人IgG1免疫球蛋白、FITC標記的鼠抗人IgG1免疫球蛋白均為美國 BD公司產品。流式細胞術檢測人細胞。采靜脈血2 mL，肝素抗凝，兩倍體積的PBS稀釋，采用淋巴細胞分離液分離出外周血單個核細胞(PBMNC)，調整細胞密度至1×107/mL，各取PBMNC懸液10 μL于標本試管中，分別加入FITC標記的CD4和PE標記的CD25各20 μL，陰性對照管加入 FITC標記的CD4和PE標記的鼠 IgG1各20 μL，室溫避光孵育20min，加冷PBS洗滌1次，重新懸浮細胞后上流式細胞儀檢測。

1.3.3 血漿IFN-γ和IL-4的檢測 血漿IFN-γ和IL-4的測定，采用ELISA雙抗夾心法，操作按試劑盒說明，檢測試劑盒購自美國R＆D systems公司。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較用雙t檢驗，組間計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組轉錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA表達量比較 與對照組相比，AA組的T-bet mRNA相對表達量升高(P＜0.01)，GATA-3、FoxP3 mRNA相對表達量降低(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 兩組轉錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA相對表達量比較(±s)

表2 兩組轉錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

組別 n T-bet GATA-3 FoxP3 AA組 27 4.78±1.24△ 1.08±0.12* 0.26±0.01△對照組25 1.12±0.17 1.27±0.41 1.31±0.11

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

2.3 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較 AA組血漿中IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4高于對照組(P均＜0.01)。見表4。

表4 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較(±s)

表4 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別 n IFN-γ(pg/mL)IL-4(pg/mL) IFN-γ/IL-4對照組25 8.57±0.85 4.86±0.68 1.65±0.42 AA組 27 15.32±2.97* 5.42±0.49 2.54±0.46*

3 討論

AA的發(fā)病機制除與造血干細胞本身缺陷、造血微環(huán)境損傷有關外，免疫異常是一個絕對不可忽視的因素。現(xiàn)有學者認為，大多數(shù)患者發(fā)病與自身免疫反應導致的造血干細胞受損有關。國內外研究結果表明，AA患者外周血中Th1細胞及Th1/Th2均明顯高于正常對照人群［5］，即 AA患者 Th1、Th2之間的分化平衡被打破，并發(fā)展為Th1型優(yōu)勢的免疫應答，存在Th1細胞的過度分化和Th1型細胞因子的過度分泌。研究發(fā)現(xiàn)，T-bet是Th1特異的轉錄因子［6］，不僅控制 Th1細胞特征性細胞因子 IFN-γ的表達，且抑制Th2細胞特征性細胞因子IL-4的合成［7］。GATA-3則是Th2細胞特異性轉錄因子，能抑制IFN-γ的表達，促進Th2細胞特征性細胞因子IL-4等的產生。FoxP3(叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子P3)是調節(jié)性T細胞特異性的轉錄因子，目前被公認為是調節(jié)性T細胞最具有特異性的分子標志物調節(jié)性T細胞能獨立表達Foxp3 mRNA。Foxp3對調節(jié)性T細胞是一正向調節(jié)蛋白，可以調節(jié)調節(jié)性T細胞的發(fā)育和功能效應，參與了免疫耐受的分子機制［8］。因此，細胞特異性轉錄因子T-bet、GATA-3與FoxP3共同調節(jié)Th細胞的極性分化。本研究結果顯示，與對照組相比，AA組的T-bet顯著升高，表明AA組患者PBMC中T-bet mRNA相對表達水平顯著高于對照組表達水平。GATA-3和FoxP3降低，表明AA組患者外周血單個核細胞GATA-3和FoxP3 mRNA相對表達水平顯著低于對照組表達水平。

本研究結果表明，AA存在T淋巴細胞亞群的功能紊亂及B淋巴細胞增殖活化;表現(xiàn)為調節(jié)性T細胞的減低，其特異性的轉錄因子FoxP3 mRNA表達下調，調節(jié)性T細胞的減少并由此引起免疫抑制效應不足可能是AA發(fā)生的重要原因之一，但AA發(fā)生、發(fā)展的詳細分子機制尚需進一步深入研究。

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