α-酮酸的合成方法及應(yīng)用研究

堵國成 ， 宋 陽 ， 劉 龍 ， 李江華 ， 陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

α-酮酸是一類雙官能團(tuán)有機(jī)化合物，是有機(jī)合成、藥物合成及生物合成的重要中間體，已廣泛用于醫(yī)藥、化學(xué)合成、化妝品、飼料和食品領(lǐng)域。在生物體內(nèi)，α-酮酸作為氨基酸脫氨基的產(chǎn)物，氨基酸合成的最后一步，是氨基酸代謝中的重要物質(zhì)。生物體內(nèi)必須的20種氨基酸中，有12種經(jīng)歷酮酸形式，通過轉(zhuǎn)氨基作用，生產(chǎn)相應(yīng)的氨基酸，見表1。

表1 酮酸及其衍生物的用途Table 1 Application of α-keto acids and itsderivatives

1 化學(xué)合成法

自1835年，第一個α-丙酮酸通過化學(xué)合成的方法被人工合成以后，出現(xiàn)了大量關(guān)于α-酮酸的合成和性質(zhì)的報(bào)道，1947年Waters綜述了關(guān)于α-酮酸的合成方法[10]。1958年和1964年，Cordier著重綜述了芳香族酮酸的合成，此后，隨著分析和合成技術(shù)手段的發(fā)展，進(jìn)一步擴(kuò)展和完善了各類合成方法[9]。但是，α-酮酸的化學(xué)合成方法不僅條件苛刻，而且需要特殊結(jié)構(gòu)的起始物，產(chǎn)率一般較低，幾乎無法用于工業(yè)化的生產(chǎn)。除此之外，在化學(xué)合成中，需要加入劇毒性原料，如氰化物水解法、α-酮酸酯水解法等，對環(huán)境和生產(chǎn)人員都會造成巨大的毒害作用，所以逐漸不被人們采用。

之后，化學(xué)合成法進(jìn)一步改進(jìn)。1975年，Perron[10]發(fā)明的雙羧基化法，該方法可以一步合成α-酮酸，而且操作簡單，產(chǎn)品易于分離，與之前的方法相比，有較大的進(jìn)步。但是，由于催化劑八羧基二鈷與零價(jià)鈀的絡(luò)合物，價(jià)格昂貴，所以不適合大規(guī)模的生產(chǎn)。在1986年，海因法成功用于苯丙酮酸的合成，東南大學(xué)的丁威[11]又對此方法做了改進(jìn)，制備了高純度的α-酮異己酸。

目前，化學(xué)法合成α-酮酸見圖1。普遍存在原料復(fù)雜、工藝繁瑣等缺點(diǎn)，所以尋求一條低成本，操作方法簡單的合成路線就尤為重要。目前，需要化學(xué)合成方面的進(jìn)一步豐富和完善合成方法，以獲得高收率，高純度的α-酮酸，達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求。

2 發(fā)酵法合成酮酸

發(fā)酵法是利用微生物的代謝過程將碳源和氮源等營養(yǎng)物質(zhì)通過代謝途徑合成天然產(chǎn)物。發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮酸是在底物中添加葡萄糖，利用中心代謝途徑，加強(qiáng)酮酸合成途徑的通量，阻斷其他分支代謝，以及阻斷酮酸向氨基酸轉(zhuǎn)化的酶，進(jìn)而保證酮酸的大量積累。

在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中，F(xiàn)elix等人[12]通過一系列代謝改造策略合成了α-酮異戊酸（即纈氨酸前體）。在微生物和植物體內(nèi)，2分子的丙酮酸合成1分子的α-酮異戊酸主要經(jīng)過3個酶：羥乙酸合成酶（AHAS，由ilvBN編碼）、乙酰乳酸異構(gòu)酶（AHAIR，由ilvC編碼）、雙羥基酸脫水酶（DHAD，由ilvD編碼）。首先，他們將轉(zhuǎn)氨酶基因（transaminase B）和丙酮酸脫氫酶的E1p亞基aceE敲除，α-酮異戊酸產(chǎn)量達(dá)到40 mmol/L。其次，為了解除從丙酮酸到α-酮異戊酸代謝流的限制，過量表達(dá)谷氨酸棒桿菌自身來源的ilvBNCD基因，在添加葡萄糖和醋酸鹽的情況下，α-酮異戊酸的產(chǎn)量在72 h時(shí)達(dá)到95 mmol/L，產(chǎn)量提高了1.375倍。最后，為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量，根據(jù)丙酮酸的代謝流分析，敲除編碼丙酮酸氧化脫羧酶的pqo基因，從而使丙酮酸向α-酮異戊酸的代謝流增強(qiáng)，結(jié)果產(chǎn)量大幅度提高，達(dá)到220 mmol/L，是敲除以前產(chǎn)量的1.32倍。

目前，依賴α-酮酸途徑合成支鏈乙醇的研究較多，其中，關(guān)于α-支鏈酮酸途徑的改造對發(fā)酵法生產(chǎn)α-支鏈酮酸有著重要的借鑒意義。Escherichia coli[13]，Corynebacterium glutamicum[14]，Bacillus subtilis[15]3種模式菌株都已經(jīng)有通過α-酮酸中間體合成支鏈乙醇的研究。異源表達(dá)不同來源的AHAS，異丁醇的產(chǎn)量有所差別。來自C.glutamicum的alsS在枯草桿菌中表達(dá)，異丁醇的產(chǎn)量為1.58 g/L。來自枯草桿菌的alsS基因在C.glutamicum表達(dá)后，異丁醇的產(chǎn)量達(dá)到2.6 g/L。除此之外，AHAS是合成分支氨基酸的關(guān)鍵酶，同時(shí)受到α-酮酸的調(diào)節(jié)，其中α-酮異戊酸與底物競爭性抑制酶活，而同一途徑的另兩種酮酸（α-酮異己酸，2-酮-3-甲基戊酸）對酶活性影響較小。而且抑制作用的作用點(diǎn)大概在ilvC編碼的亞基的活性中心位置，與ilvN編碼的亞基關(guān)系不大，而ilvN編碼的亞基與支鏈氨基酸的抑制作用相關(guān)，所以支鏈酮酸與支鏈氨基酸的作用位點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制不同。綜上，依賴不同的代謝途徑改造方法，繼續(xù)增強(qiáng)AHAS酶的活力，改善丙酮酸向酮酸合成的流量，對發(fā)酵法生產(chǎn)酮酸有著重要意義。

圖1 α-酮酸化學(xué)合成法Fig.1 Production of α-keto acid by chemical synthesis

3 轉(zhuǎn)化法合成酮酸

轉(zhuǎn)化法是利用微生物中某些酶的高選擇性的催化特性，對底物的某一部分進(jìn)行有效的催化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為與底物結(jié)構(gòu)類似，價(jià)值更高的產(chǎn)品。轉(zhuǎn)化法可以依賴純酶，粗酶液，也可以是游離或固定化的細(xì)胞，其反應(yīng)類型種類豐富，操作簡單，條件溫和，具有高選擇性、高效性、無毒、無污染等特點(diǎn)，廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。目前轉(zhuǎn)化法已用于消旋體的制備、手性化學(xué)中間體的合成、生物能源的轉(zhuǎn)化、活性化學(xué)品的生產(chǎn)等，如：D型和L型2-奈-丙酮酸的分離，由頭孢菌素C合成7-氨基頭孢菌烷酸、2，3-丁二醇的生物轉(zhuǎn)化、灰色鏈霉菌生物轉(zhuǎn)化合成蘆丁等。轉(zhuǎn)化法受到多種因素的影響，不論酶轉(zhuǎn)化和微生物轉(zhuǎn)化，對特定酶的改造都是至關(guān)重要的。轉(zhuǎn)化法還受到溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)、抑制劑、底物濃度等多方面的影響，以及轉(zhuǎn)化過程的有機(jī)相、雙水相等不同催化體系的影響，因此可以通過調(diào)節(jié)控制因素和改變催化體系等手段來提高酶的活性和轉(zhuǎn)化效率。

目前，從氨基酸向酮酸轉(zhuǎn)化的酶主要有3種：轉(zhuǎn)氨酶（Aminotransferase，AT，EC 2.6.2.X）[16]、氨基酸氧化酶 （amino acid oxidase，AAO，EC 1.4.3.2 和 EC 1.4.3.3）[17-19]、膜聯(lián)L-氨基酸脫氨酶 （L-amino acid deaminase，LAD，EC 1.4.3.2）[20]。其中 L-AAO 和 DAAO都可以催化脫氨反應(yīng)，生成相應(yīng)的酮酸、氨和過氧化氫。而表達(dá)在細(xì)胞膜上的膜聯(lián)LAD在脫氨過程中，不會生成過氧化氫，免除了過氧化氫對細(xì)菌的毒害作用，極大地方便了脫氨酶的異源表達(dá)。

3.1 氨基轉(zhuǎn)移酶

氨基轉(zhuǎn)移酶是一類以吡哆醛-5-磷酸 （PLP）為輔因子的用于氨基轉(zhuǎn)移的酶。這類酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多，它可以將氨基轉(zhuǎn)給酮酸或者甲酮（多數(shù)以α-酮戊二酸為底物），生成另一種酮酸和谷氨酸[21]。在生物體內(nèi)，氨基轉(zhuǎn)移酶的作用范圍廣泛，產(chǎn)物多種多樣，在肝、腦、腎和多種組織中都發(fā)揮重要作用。同時(shí)，氨基轉(zhuǎn)移酶含量也可以作為以作為肝炎、血脂異常等疾病的診斷指標(biāo)[22-23]。雖然氨基轉(zhuǎn)移酶的底物來源廣泛，但是氨基轉(zhuǎn)移酶在工業(yè)生產(chǎn)中面臨底物/產(chǎn)物抑制，α-酮異戊酸的成本高以及氨基轉(zhuǎn)移酶對溫度穩(wěn)定性差等問題，限制了氨基轉(zhuǎn)移酶在酮酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3.2 氨基酸氧化酶

L和D型氨基酸氧化酶是目前研究較多的兩種具有脫氨基作用的酶。大多數(shù)氨基酸氧化酶是依賴FAD為輔酶的黃素蛋白，可以催化氨基酸氧化脫氨生成相應(yīng)的酮酸、過氧化氫和氨基。催化過程可以分為兩步：第一步是從氨基酸脫下來的氫傳遞給輔酶FAD生成氨基酸的中間形式，然后立即水解生成酮酸和氨基。第二步是FAD的氫原子將O2還原成過氧化氫，通常在亞氨基酸分解前完成[24]。氨基酸氧化酶的用途主要分為兩類：一類是分泌于體表的氨基酸氧化酶通常是作為分泌者的殺菌劑，因?yàn)樯傻倪^氧化氫可以有效抑制細(xì)菌感染[25-27]；另一類表達(dá)在體內(nèi)或者細(xì)菌來源的氨基酸氧化酶則是參與到氮采集和氨基酸代謝中。氨基酸氧化酶來源廣泛，存在于動物、昆蟲、細(xì)菌、真菌中。蛇毒以及昆蟲來源的AAO仍然是氨基酸氧化酶家族的重要一類，而自1944年細(xì)菌（Proteus vulgaris）來源的氨基酸氧化酶被發(fā)現(xiàn)以后，細(xì)菌來源的AAO由于來源廣泛，無毒性等特點(diǎn)逐漸受人重視[28]。從此以后，多種氨基酸氧化酶被發(fā)現(xiàn)，在19世紀(jì)90年代后，酶的結(jié)構(gòu)成為研究重點(diǎn)，Moustafa等人[29]和Faust等人[30]分別獲得了來源于蛇毒 （Calloselasma rhodostoma）和細(xì)菌（Rhodococcus opacus）的氨基酸氧化酶的結(jié)構(gòu)，同時(shí)闡明了該酶的活性位點(diǎn)、作用機(jī)制、底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)通道。不同來源的氨基酸氧化酶有不同的底物范圍，如來源于Rhodococcus opacus的LAAO可以氧化39種氨基酸及衍生物，而有一些氨基酸氧化酶只可以嚴(yán)格地利用某一構(gòu)型的一種氨基酸為底物，這類AAO通常以其底物的名稱命名，如來自于Bacillus subtilis的甘氨酸氧化酶 （L-gycine oxidase）[31]、來自Streptomyces sp.的谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase）[32]。而在異源表達(dá)方面，可能需要轉(zhuǎn)錄后修飾等，只有幾個LAAO異源表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道。在2003年，來源于R.opacus的LAAO分別在E.coli和 Streptomyces lividans中異源表達(dá)，在E.coli中，過量表達(dá)的酶以包涵體形式存在，而且沒有酶活，而與基因來源菌同源性較高的Streptomyces lividans則可以作為異源表達(dá)穩(wěn)定的宿主[33]。DAAO異源表達(dá)的研究較多，R.gracilis和T.variabilis來源的DAAO在畢赤酵母中表達(dá)，并且酶的產(chǎn)量達(dá)到350 000 U/L和220 000 U/L。近年來，DAAO的改造成為研究熱點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變、酶的融合等手段，擴(kuò)大了DAAO的底物范圍，改變了催化特性。以R.gracilis來源的DAAO為例，改造前此酶無法利用天冬氨酸，經(jīng)過M213R突變后，對天冬氨酸的氧化能力基本達(dá)到與D-天冬氨酸氧化酶同樣的活力[34]。經(jīng)過M213G突變的 Rg.DAAO可以提高對D-2-奈-丙酮酸的親和力，酶的Cα-H的位置在空間構(gòu)像上更有利于底物結(jié)合，突變后的DAAO可以將98%的D-2-奈-丙酮酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的L型，并且轉(zhuǎn)化效率提高10倍[35]。R.gracilis來源的DAAO還與T.variabilis來源的DAAO發(fā)揮不同優(yōu)勢融合成一個酶，但是只是輕微的提高熱穩(wěn)定性（2~5 ℃）[36]。

3.3 氨基酸脫氨酶

膜聯(lián)LAD由于具有不產(chǎn)生過氧化氫，更容易異源表達(dá)的特點(diǎn)，近年來成為研究熱點(diǎn)。膜上表達(dá)的LAD多 為 來 自 細(xì) 菌 ， 如 Proteus，Providencia、Morganellas等。不同基因編碼的LAD底物范圍以及親和性也各不相同，甚至來源于同一菌株的不同基因編碼的酶也會表現(xiàn)出不同的底物特異性，如Proteus mirabilis來源的PM1只能催化幾種氨基酸，而Proteus mirabilis來源的PMA可以催化大多數(shù)的氨基酸。膜聯(lián)LAD由于在催化過程中不產(chǎn)生過氧化氫，消除來了過氧化氫對細(xì)菌的毒害作用，擴(kuò)展了異源表達(dá)的宿主范圍。來源于Proteus mirabilis的pm1已經(jīng)成功在E.coli BL21（DE3）表達(dá)，確定了其對組氨酸、谷氨酸、精氨酸和苯丙氨酸的催化效率較高[20]。來源于Proteus myxofaciens的LAAD在E.coli K12中也成功表達(dá)，通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化確定這個酶主要對脂肪族、芳香族和含硫側(cè)鏈的氨基酸催化效率較高，并且通過初步純化表明此酶表達(dá)在細(xì)胞膜上。膜上表達(dá)的LAD通常在N端有信號肽序列，通過前導(dǎo)肽定位在細(xì)胞膜上。Gazi等人[9]試圖將Proteus mirabilis來源的膜聯(lián)LAD變成游離表達(dá)，將N端的21~87個核苷酸去除，結(jié)果過量表達(dá)的酶為包涵體形式，通過復(fù)性和純化后，酶量為最初的40%，測定的動力學(xué)參數(shù)與膜上表達(dá)的LAD基本相同?？赡苄盘栯呐c酶的折疊相關(guān)，如果單純?nèi)コ盘栯模笩o法正確折疊，進(jìn)而無法獲得有活性的LAD。

4 展望

α-酮酸作為氨基酸脫氨基的產(chǎn)物，在化學(xué)、醫(yī)藥、食品、化妝品領(lǐng)域有著大量的需求，而以氨基酸為原料，將低成本的氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)高附加值的酮酸，可以獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。目前酮酸的生物合成方法中，代謝工程改造菌種生產(chǎn)α-酮酸有著廣闊的前景，目前發(fā)酵法生產(chǎn)酮酸的產(chǎn)量較低，可以通過進(jìn)一步的代謝改造提高酮酸產(chǎn)量。雖然具有將氨基酸轉(zhuǎn)化成酮酸能力的酶種類繁多，但是微生物轉(zhuǎn)化法目前研究較少，可以依賴膜聯(lián)LAD進(jìn)一步提高酶的底物特異性和酶活，或者采用固定化的方法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。而且膜上表達(dá)的LAD目前僅僅在大腸桿菌中異源表達(dá)，可以通過利用不同細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的宿主菌，使得酶活進(jìn)一步提高，早日實(shí)現(xiàn)α-酮酸的生物法大規(guī)模生產(chǎn)。

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