黃芪甲苷單克隆抗體的制備及鑒定

于生蘭，歐陽臻 ，徐加兵，王帥兵

1江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江212013;2江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300;3江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013

黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，簡稱AST)是中藥黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，為黃芪及其制劑質(zhì)量鑒定的指標(biāo)成分。藥理研究表明:AST具有調(diào)節(jié)機體免疫力、保護(hù)組織器官、降低血糖、抗細(xì)胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的作用，具有非常廣闊的發(fā)展前景［1］。目前檢測AST的方法有高效液相色譜法(HPLC)、薄層掃描法(TLCS)、比色法、熒光法等，但這些方法或者操作復(fù)雜，靈敏度低，或者分析成本高，耗時長?；诳乖贵w反應(yīng)的酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)是一種新型的分析方法，可以有效解決傳統(tǒng)方法所存在的問題。本實驗采用人工合成的方法制得AST與牛血清白蛋白(BSA)的免疫抗原(ASTBSA)，通過細(xì)胞融合制備McAb。旨在為ELISA法檢測中藥黃芪及其制劑中黃芪甲苷的含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

AST標(biāo)準(zhǔn)品(含量98%，HPLC)，成都曼思特生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)均來自Sigma公司;羊抗鼠酶標(biāo)抗體，武漢博士德生物有限公司;Balb/c小鼠，雌性，體重16～18 g，揚州大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(蘇)2012-0004。

1．2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE);MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(Applied Biosystem，4800型);普通、高速離心機(Labnet);超低溫冰箱(Heto);生物顯微鏡(OLYMPUS);酶標(biāo)儀(BIO2TEK);微量移液器。

1．3 方法

1．3．1 AST-BSA人工抗原的合成與鑒定

1．3．1．1 AST-BSA 人工抗原的合成

將AST的甲醇溶液(濃度為8 mg/mL)逐滴加入NaIO4溶液內(nèi)(濃度為12．5 mg/mL)，攪拌1 h后，再慢慢加入含有BSA的50 mmol/L(pH 9．6)的碳酸緩沖液(BSA 10 mg溶于碳酸緩沖液2．8 mL)，用1 mol/L的Na2CO3調(diào)整反應(yīng)混合液的pH值至9．0，于室溫下攪拌6 h后，將反應(yīng)液對蒸餾水透析3 d，再經(jīng)凍干處理，即得到AST-BSA復(fù)合物［2］。

AST-OVA采用同樣的方法合成。

1．3．1．2 AST-BSA 人工抗原的鑒定(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法)

經(jīng)ZipTip C4脫鹽處理后取1μL蛋白樣品點至樣品靶上，自然干燥后，再取0．6μL SA基質(zhì)溶液點至對應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標(biāo)準(zhǔn)品。

在正離子模式下選擇線性方法對樣品測試范圍進(jìn)行校準(zhǔn)測試。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)范圍為:39212±100、66430±100。在正離子模式下選擇線性方法測試樣品分子量。根據(jù)分子量測定結(jié)果，計算偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比=(MrAST-BSA-MrBSA)/MrAST［3］

1．3．2 分泌抗AST雜交瘤細(xì)胞株的建立［4］

以50μg AST-BSA(溶于150μL PBS)與完全福氏佐劑1∶1混勻成乳液，腹腔注射Balb/C小鼠(3只，6周齡)，間隔2周，腹腔注射交聯(lián)抗原AST-BSA(與第一次比例相同，弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑)，追加免疫3次，2周后，末次加強免疫。3d后取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合。SP2/0細(xì)胞(1×107)與免疫鼠脾細(xì)胞(1×108)按1∶10的比例混合，加入 0．5 mL 50%PEG-4000進(jìn)行融合。融合后細(xì)胞轉(zhuǎn)入含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);3 d后，加入HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。用間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測抗體，選擇抗體分泌陽性孔，采用有限稀釋法，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，選擇單個細(xì)胞集落孔的培養(yǎng)上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細(xì)胞生長的抗體分泌陽性率為100%。

1．3．3 單克隆抗體的大量制備與鑒定

取12周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟(每只0．4 mL)。1周后每只小鼠腹腔注射5×105個雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部明顯隆起時(注射后約10 d)收集腹水，2000 rpm離心10 min，吸取上清分裝，-20℃凍存。采用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法純化腹水，腹水效價測定用間接ELISA方法［5］。

1．3．4 單克隆抗體的特異性檢測

用間接競爭ELISA法檢測抗體特異性［6］，包被抗原為AST-OVA。根據(jù)OD450判定所產(chǎn)生的抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2．1 人工抗原AST-BSA偶聯(lián)比的確定

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜結(jié)果見圖1(A)、(B)。測定結(jié)果表明:BSA分子量為66446．4766;AST-BSA偶聯(lián)物分子量為76970．9609，計算出其偶聯(lián)比為(76970．9609-66446．4766)/784．97≈13。

2．2 單克隆雜交瘤細(xì)胞株的制備與鑒定

取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，融合后共接種5塊板，其中10孔加對照細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)，故融合細(xì)胞接種孔數(shù)為470個，培養(yǎng)后有雜交瘤細(xì)胞克隆生長孔數(shù)目為325孔，融合率為69．2%。第1次用間接ELISA法篩選，獲得陽性孔為94孔，故第1次篩選的陽性率為20．0%。

將獲得的94孔雜交瘤細(xì)胞再進(jìn)行亞克隆，并經(jīng)過ELISA篩選和鑒定，獲得了23個陽性雜交細(xì)胞亞克隆細(xì)胞株。對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液進(jìn)行間接ELISA檢測，取效價高且特異性強的陽性孔雜交瘤，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，經(jīng)過3次亞克隆和篩選，最后獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗AST單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1D5、3D11(細(xì)胞培養(yǎng)見圖2)。

3 討論

3．1 人工抗原的合成與鑒定

作為一個完全抗原必須同時具備T細(xì)胞和B細(xì)胞表位。小分子物質(zhì)由于分子太小一般難以同時擁有兩個表位，必須將其連接到一些大分子蛋白載體以形成偶聯(lián)物，借助大分子T細(xì)胞表位間接誘導(dǎo)B細(xì)胞激活、分化增殖，產(chǎn)生針對半抗原的特異性抗體［7］。AST是一種含糖半抗原，對于半抗原與載體的偶聯(lián)，傳統(tǒng)的人工抗原的合成方法有混合酸酐法、活潑酯法、碳二亞胺法及高碘酸鈉法。本實驗參考人參皂苷單克隆抗體的制備采用高碘酸鈉法［2］，結(jié)果表明合成效率較高，合成方法簡便可行。

3．2 動物免疫實驗

本實驗制備單克隆抗體的目的是為了建立中藥黃芪及其制劑中黃芪甲苷的ELISA檢測方法，要求單克隆抗體有較高的親和力，所以選擇了皮下注射與腹腔注射相結(jié)合，并制定了小劑量、長周期、多次數(shù)的免疫方案，使得含黃芪甲苷的抗原分子產(chǎn)生了很強的免疫原性。小鼠免疫間隔時間為2周，融合前3 d不加佐劑直接用AST-BSA進(jìn)行強化免疫，其目的是促進(jìn)小鼠脾臟內(nèi)正處于增殖狀態(tài)的B淋巴細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最多。結(jié)果表明，選擇的實驗動物個體、數(shù)量及其免疫方案是可行的，免疫效果理想。

3．3 間接ELISA方法建立

本實驗對間接ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行了探索，建立了靈敏、特異、操作簡單、適于大批量含黃芪甲苷成分含量的檢測方法，為黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷的免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)。作者下一步將對建立的檢測方法的靈敏度、交叉反應(yīng)等進(jìn)行研究，為以后研制適合黃芪甲苷的檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

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