藏紅花花瓣體外抗氧化活性部位的篩選與研究

黃一泓，劉雅莉，武文斌，張 雯

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200062

藏紅花(Saffron，Crocus sativus L．)，又名番紅花、西紅花、洎夫藍(lán)、撒法即，為鳶尾科番紅花屬多年生草本植物，據(jù)《中華人名共和國(guó)藥典》記載，其藥用部位為干燥的花柱，藏紅花作為傳統(tǒng)中藥其功效為:活血化瘀，涼血解毒，解郁安神。用于經(jīng)閉癥瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，憂郁痞悶，驚悸發(fā)狂等［1］。除藥用外，它可用作食品添加劑、食用色素和高級(jí)香料。近年對(duì)藏紅花的藥理研究表明，其花柱中的主要有效成分—藏紅花苷對(duì)于癌癥、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂癥等多種疾病具有較好的防治作用［2］。其花柱因產(chǎn)量極低同時(shí)具有神奇的藥效而被世人封以“植物黃金”的稱號(hào)，同時(shí)，大量的非藥用部位—花瓣在藏紅花的制藥工業(yè)中成為副產(chǎn)品，造成極大的資源浪費(fèi)。已有學(xué)者從藏紅花花瓣的甲醇提取物中分離得到35個(gè)單體化合物，主要為萜類和黃酮醇類［3］。有研究顯示:藏紅花花瓣提取物對(duì)抑郁癥有一定的療效［4］，并對(duì)DPPH自由基、白血病細(xì)胞、白色念珠菌有一定的抑制作用［5］。此外從花瓣中分離到的黃酮醇類單體對(duì)酪氨酸酶有較好的抑制作用［6］。上述研究表明藏紅花花瓣具有活性成分及功能，具備進(jìn)一步利用的基礎(chǔ)。

為此，本研究以廢棄的藏紅花花瓣為材料，利用體外抗氧化活性體系篩選出其活性部位，并從清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化兩方面對(duì)其展開研究，旨在填補(bǔ)研究空白，延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈，為藏紅花的深度利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 藥品與動(dòng)物

總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒，購自南京建成生物工程研究所;2，2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH·)，購自Sigma公司;硫酸亞鐵(Fe-SO4·7H2O)、水楊酸、30%H2O2、鹽酸、鄰苯三酚、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、無水乙醇、硫代巴比妥酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。ICR雄性小鼠，體重18～20 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1．1．2 主要儀器

粉碎機(jī)(上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司);RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);7200型可見分光光度計(jì)(上海市第三分析儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);梅特勒-托利多B-L系列電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);TL-16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)機(jī)械研究所)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 原料預(yù)處理

藏紅花花瓣，由浙江壽仙谷藥業(yè)提供，由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李宏慶副教授鑒定。置烘箱50℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，密封袋避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 藏紅花花瓣不同極性部位的制備

準(zhǔn)確稱取100 g藏紅花花瓣干粉末，于10倍體積70%的乙醇60℃下回流提取3次，過濾，合并濾液，45℃減壓濃縮，真空冷凍干燥，得到藏紅花花瓣提取物45．97 g。稱取10 g藏紅花花瓣提取物，溶入蒸餾水中，混勻，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入相同體積的石油醚，振搖10 min，放氣，靜置8 h后，放出下層水溶液，收集石油醚部分;下層水溶液用同法繼續(xù)萃至上層液體無色為止，合并石油醚萃取液，減壓濃縮，濃縮液真空冷凍干燥即得到0．752 g藏紅花花瓣提取物的石油醚相(PE)。石油醚萃取后的剩余水溶液按上述方法依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到0．985 g氯仿相(T)、1．005 g乙酸乙酯相(EA)、1．254 g正丁醇相(B)。正丁醇萃取后的剩余水溶液直接在60℃下減壓濃縮，真空冷凍干燥得到4．676 g藏紅花花瓣提取物的水相(W)部分。

1．2．3 藏紅花花瓣體外抗氧化活性部位的篩選

用含1%DMSO的無水乙醇將藏紅花花瓣5個(gè)不同極性部位的提取物分別配成 0．1、0．5、1、5 mg/mL的溶液作為供試液備用。

1．2．3．1 DPPH·清除能力測(cè)定

按照文獻(xiàn)［7］方法略作改動(dòng)，在 1．9 mL，0．065 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液中分別加入0.1 mL供試液。室溫放置30 min，于517 nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行，取平均值。以1%DMSO的無水乙醇代替樣品作為空白對(duì)照，吸光度為A0;以無水乙醇代替DPPH自由基溶液作為樣底管吸光度為A2。DPPH自由基清除能力測(cè)定計(jì)算公式如下:

清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］ ×100%

1．2．3．2 羥基自由基清除能力測(cè)定

按照Smirnoff的方法［8］略作改動(dòng)，在試管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵1 mL，6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，分別加入1 mL供試液，混勻后后加入0．1%的H2O2溶液1 mL，以蒸餾水補(bǔ)足至總體積5 mL。其中對(duì)照管以1 mL含1%DMSO的無水乙醇代替樣液，樣底管以乙醇代替水楊酸溶液，搖勻后37℃水浴0．5 h，離心，510 nm處測(cè)定吸光值。清除率計(jì)算公式如下:

清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］ ×100%

式中，A1為供試液的吸光度平均值;A2為樣底管吸光度平均值;A0為對(duì)照管吸光度平均值。

1．2．3．3 超氧陰離子清除能力測(cè)定［9］

取0．05 mol/L的 PBS緩沖溶液(pH=8．0)2.25 mL，分別加入0．5 mL供試液和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0．2 mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入 0．5 mL 80 mmol/L 的 HCI終止反應(yīng)，于420 nm處測(cè)定吸光度A1，空白對(duì)照以同體積的1%DMSO的無水乙醇代替樣品;為排除供試液顏色干擾，樣底管用同體積的無水乙醇代替鄰苯三酚溶液。

清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100%

式中:A1為供試液的吸光度平均值;A2為樣底管的吸光度平均值;A0為空白對(duì)照管的吸光度平均值。

1．2．3．4 總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定

不同極性部位總抗氧化能力的測(cè)定使用總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒進(jìn)行，方法按照說明書操作。

1．2．4 藏紅花花瓣活性部位對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

取上述試驗(yàn)中對(duì)自由基清除效果最強(qiáng)的部位為研究對(duì)象，配置成 0．1、0．25、0．5、1、5、10 mg/mL 的溶液作為供試液備用。

1．2．4．1 藏紅花花瓣提取物活性部位對(duì)紅細(xì)胞自發(fā)性氧化溶血的抑制作用［10］

小鼠眼眶取血，制成抗凝血，4℃，4000 rpm離心5 min，去除上層溶液，紅細(xì)胞用預(yù)冷的生理鹽水洗滌3次制成0．5%的紅細(xì)胞懸液備用。

取0．5%紅細(xì)胞懸液1．5 mL，分別加入 0．1 mL試樣，空白對(duì)照為等體積蒸餾水，混勻，于37℃溫育24 h后用生理鹽水稀釋4倍，4000 rpm離心10min，取上清液于540 nm處測(cè)定OD值。

對(duì)紅細(xì)胞自氧化溶血的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對(duì)照的平均吸光度值。

1．2．4．2 藏紅花花瓣提取物活性部位對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

取1．2．4．1 制備的 0．5% 紅細(xì)胞懸液 1 mL，分別加入0．1 mL試樣(空白對(duì)照為等體積蒸餾水代替)，加入0．5 mL的50 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，混勻，37℃溫育1 h后生理鹽水稀釋4倍，4000 r/min離心10 min，取上清液于415 nm處測(cè)定OD值。

對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對(duì)照的平均吸光度值。

1．2．4．3 藏紅花花瓣提取物活性部位對(duì)肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用［11］

小鼠頸椎脫臼致死，迅速取出肝臟，用冰冷的生理鹽水洗凈，加入10倍體積冰冷的生理鹽水，冰浴勻漿，得到10%的肝臟勻漿液備用。取1 mL肝勻漿液于玻璃試管中，分別加入0．5mL不同濃度的供試樣，空白對(duì)照加入等體積蒸餾水，混勻37℃溫浴1 h，加入1mL的20%三氯乙酸(TCA)溶液，混勻后再加入0．7%的硫代巴比妥酸溶液1．5 mL，沸水浴保持15 min，4000 rpm離心10 min，取上清液于波長(zhǎng)532 nm處測(cè)定OD值。

對(duì)肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對(duì)照的平均吸光度值。

1．2．4．4 藏紅花花瓣提取物活性部位對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用

取1．2．4．3 制備的肝臟勻液 1 mL，分別加入0.5 mL不同濃度的供試樣，空白對(duì)照加入等體積蒸餾水，混勻37℃溫浴15 min，各試管中加入0．1 mL 100 mmol/L H2O2，混勻 37 ℃溫浴 0．5 h，再分別加入1 mL 20%的三氯乙酸終止反應(yīng)，然后加入1 mL 0．7%的硫代巴比妥酸溶液，混勻后于沸水中顯色15 min，4000 rpm離心10 min，去除蛋白質(zhì)沉淀取上清液于波長(zhǎng)532 nm處測(cè)定OD值。

對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對(duì)照的平均吸光度值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 藏紅花花瓣提取物體外抗氧化活性部位的篩選

2．1．1 藏紅花花瓣不同極性部位對(duì)DPPH·的清除作用

圖1 藏紅花花瓣提取物5個(gè)不同極性部位對(duì)DPPH·的清除作用Fig.1 Scavenging effects of five fractions with different polarities on DPPH·

由圖可知藏紅花花瓣提取物的5個(gè)極性部位對(duì)DPPH·均有一定的清除作用，除乙酸乙酯相外，其他部位的清除作用沒有表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)。5 mg/mL時(shí)各極性部位對(duì)DPPH·的清除率分別為:石油醚相24．54%，氯仿相22．97%，乙酸乙酯相34.95%，正丁醇相25．54%，水相12．29%。

圖2 藏紅花花瓣提取物5個(gè)不同極性部位對(duì)的清除作用Fig.2 Scavenging effects of five fractions with different polarities on

2．1．2 藏紅花花瓣不同極性部位對(duì)超氧陰離子的清除作用

各部位在1 mg/mL時(shí)對(duì)O-·2的清除作用有不同程度的增強(qiáng)，5 mg/mL時(shí)各部位對(duì)O-·2的清除率分別達(dá)到:石油醚相19．88%，氯仿相20．49%，乙酸乙酯相75．57%，正丁醇相41．81%，水相41．90%。

2．1．3 藏紅花花瓣不同極性部位對(duì)羥自由基的抑制作用

圖3 藏紅花花瓣提取物5個(gè)不同極性部位對(duì)·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effects of five fractionswith different polarities on·OH

在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，氯仿相和乙酸乙酯相對(duì)·OH的清除作用較其他3個(gè)部位強(qiáng)，各部位在5 mg/mL時(shí)·OH的清除分別為:石油醚相28．50%，氯仿相47．44%，乙酸乙酯相 52．48%，正丁醇相15.83%，水相 34．70%。

2．1．4 藏紅花花瓣不同極性部位總抗氧化能力(TAOC)的測(cè)定

在低濃度時(shí)各部位的總抗氧化能力均較弱，當(dāng)濃度升高到5 mg/mL時(shí)，各極性部位總抗氧化能力均明顯增強(qiáng)，總抗氧化能力值(單位/毫升提取物)分別為 5．51、3．15、21．49、8．87、18．92 個(gè)單位。

圖4 藏紅花花瓣提取物5個(gè)不同極性部位總抗氧化能力(T-AOC)的測(cè)定Fig.4 Total antioxidant capacity of five fractions with different polarities

上述四個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏紅花花瓣提取物的5個(gè)不同極性部位對(duì)自由基都有一定的清除作用，均表現(xiàn)出抗氧化活性，且在一定濃度范圍內(nèi)與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)效應(yīng);其抗氧化效果因反應(yīng)體系的不同而不同，且不同極性部位抗氧化活性稍有差異。綜合4中抗氧化體系評(píng)價(jià)藏紅花提取物的5種不同極性溶劑提取物，其中以乙酸乙酯相的抗氧化作用最強(qiáng)，因此選擇乙酸乙酯相作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。

2．2 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

2．2．1 乙酸乙酯相對(duì)紅細(xì)胞自氧化溶血的抑制作用

圖5 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對(duì)紅細(xì)胞自氧化溶血的抑制作用Fig.5 Inhibition effects of EA on hemolysis of mice erythrocytes

由圖5可知，EA對(duì)紅細(xì)胞自氧化溶血的抑制作用在5 mg/ml時(shí)達(dá)到40．36%，抑制作用隨著濃度的增大而加強(qiáng)，IC50為8．82 mg/mL，說明乙酸乙酯相能有效的減少紅細(xì)胞溫育過程中形成的脂質(zhì)過氧化物含量，對(duì)紅細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

圖6 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對(duì)H2 O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用Fig.6 Inhibition effects of EA on hemolysis ofmice erythrocytes induced by H2O2

2．2．2 乙酸乙酯相對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

H2O2與紅細(xì)胞產(chǎn)生氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜，引起細(xì)胞損傷。圖6中實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，且在5 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到58．91%，IC50為4.29 mg/mL，由此可見EA在細(xì)胞水平上也能夠有效抑制氧化損傷。

2．2．3 乙酸乙酯相對(duì)小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用

圖7 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對(duì)肝臟自發(fā)行性脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用Fig.7 Protective effects of EA on lipid peroxidation ofmice liver homogeate

EA對(duì)肝臟自氧化溶血的保護(hù)作用見圖7，在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度升高對(duì)肝臟自發(fā)行性脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用加強(qiáng)，并呈現(xiàn)出良好的濃度正相關(guān)趨勢(shì)，在10 mg/mL時(shí)對(duì)MDA生成的抑制率達(dá)到39．81%。

2．2．4 乙酸乙酯相對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用

圖8 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用Fig.8 Protective effects of EA on lipid peroxidation ofmice liver homogenate induced by H2 O2

H2O2刺激肝臟產(chǎn)生過氧化物MDA，其產(chǎn)量的多少可以代表組織損害的程度。由圖8實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在低濃度(0．1 mg/mL ～1 mg/mL)范圍內(nèi)EA對(duì)MDA生成的抑制作用緩慢的增強(qiáng)，但在高濃度(1 mg/mL ～10 mg/mL)范圍內(nèi)，EA對(duì)MDA生成的抑制作用隨著濃度的升高而迅速加強(qiáng)，在10 mg/mL時(shí)對(duì)MDA生成的抑制率達(dá)到47．53%，說明EA能夠有效地保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化。

3 討論

本文著重于藏紅花花被的藥效研究，以體外抗氧化系統(tǒng)來鎖定其活性部位評(píng)價(jià)其活性。自由基清除法是傳統(tǒng)的抗氧化能力測(cè)定方法之一，因?qū)嶒?yàn)方法簡(jiǎn)單快速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀準(zhǔn)確而廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)與測(cè)定抗氧化物質(zhì)的活性。又因沒有一種抗氧化體系可以全面評(píng)價(jià)比較供試品的抗氧化活性，故選取DPPH·、羥基自由基、超氧陰離子、總抗氧化能力等四個(gè)指標(biāo)來綜合評(píng)價(jià)藏紅花花瓣不同極性部位的抗氧化活性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，藏紅花花瓣提取物的5個(gè)不同極性部位均有較好的清除自由基的能力，均表現(xiàn)出抗氧化活性，其中以乙酸乙酯部位作用最明顯。

目前已有研究證明，自由基增加所引起的肝臟脂質(zhì)過氧化是許多肝臟疾病的病因，如酒精性肝炎、血色病、內(nèi)毒素性肝損害、急、慢性肝炎和肝硬化、肝臟腫瘤等［12］，因此研究出天然的抗脂質(zhì)過氧化劑具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藏紅花提取物乙酸乙酯相對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血及肝臟脂質(zhì)過氧化均有較好的保護(hù)作用，聯(lián)系其對(duì)自由基的清除作用，可推斷其保護(hù)機(jī)理可能是與H2O2作用，阻止氧化反應(yīng)的進(jìn)行，從而減少過氧化產(chǎn)物的生成。希臘學(xué)者AikateriniTermentzi［13］對(duì)藏紅花花瓣的醇提取物進(jìn)行LCMS分析發(fā)現(xiàn)，其活性成分主要為黃酮醇類以及少量生物堿。目前本實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯相的成分與作用機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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