蘆丁鍺的合成、表征及生物活性研究

翟廣玉 ，渠文濤，朱 瑋，閆影影，王素紅，王敬萍

1鄭州大學護理學院;2鄭州大學藥學院，鄭州450052

蘆丁是具有多種生物學活性的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、飲料及中草藥中，如番茄、棗、杏、蕎麥、咖啡、啤酒及槐米等。研究表明，蘆丁具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、擴張血管等多種生物學活性［1］。臨床上用于治療過敏性紫癜及各種因毛細血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等［2］。蘆丁分子中具有強配位氧原子與合適的空間構(gòu)型，是一種良好的金屬離子螯合劑［3，4］。生物活性研究顯示，蘆丁與金屬離子形成配合物后，藥效強于蘆?。?，6］。蘆丁金屬配合物的研究是近年來國內(nèi)外研究的熱點。

按照中藥配位化合理論，有機成分與微量元素組成的配合物，比純有機分子或微量元素更全面地反映中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，代表中藥活性作用的核心［7］。鍺是具有重要生理活性的微量元素之一，有機鍺具有調(diào)節(jié)免疫和造血機能、清除自由基、抗癌變、消炎等多重功效。文獻對蘆丁鍺配合物的報道較少，且抗腫瘤活性研究未見報道。作者利用蘆丁與氧化鍺在堿性條件下反應合成了蘆丁鍺配合物，并提出了該化合物可能的結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)經(jīng) UV、IR、1H NMR以及差熱分析等確證。并分別采用DPPH法和MTT法，評價了蘆丁鍺配合物的清除自由基活性及抗腫瘤活性。

圖1 蘆丁的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of rutin

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

試劑:蘆丁(純度＞95%，河南平輿馨星生化有限公司);氧化鍺(分析純);二苯基苦基肼(DPPH·)(上海晶純試劑有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(Hy-Clone，北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司);青霉素、鏈霉素(HyClone，SH40003-12);胎牛血清(無噬菌體，低內(nèi)毒素，杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司);四甲基偶氮唑藍(MTT，Sigma公司)。其他試劑均為分析純。

細胞株:Hela(人子宮頸癌細胞)、SPC-A-1(人肺腺癌細胞)、EC9706(人食管癌細胞)與PC-3(人前列腺癌細胞)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

儀器:FTS-3000型紅外光譜儀(KBr壓片);Perkin-400CHN型元素分析儀;UV-2550型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);STA 409 PC/PG差熱分析儀［德國耐馳(Netzsch)］;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。CJ-2F超凈工作臺(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SIM公司);倒置顯微鏡(德國萊卡公司);Spectra Mr型全波長酶標儀(美國DYNEX公司)。

1．2 蘆丁鍺的制備

參照文獻［8］的方法并進行了改進。取1 mmol(610 mg)蘆丁，加入25 mL甲醇，攪拌使完全溶解。加入預先配好的GeO2(1 mmol 108．5 mg)的甲醇溶液25 mL，加熱、攪拌使完全溶解，用甲醇鈉調(diào)節(jié)pH=8．5～9．0。于帶有攪拌器和冷凝管的三口燒瓶中，回流6 h。用薄層板監(jiān)控反應進程，待反應結(jié)束后蒸餾出2/3溶劑。利用聚酰胺層析柱，用甲醇/水溶液梯度洗脫，收集設定區(qū)間洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干有機溶劑得棕黃色固體，用甲醇重提，得深棕黃色固體，真空干燥。

1．3 蘆丁鍺對Hela細胞、SPC-A-1細胞和EC9706細胞增殖的影響

蘆丁鍺用DSMO溶解，用滅菌水配制成10 mmol/L的原藥貯存液，4℃保存，臨用時以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，0．22μm微孔濾膜過濾。

分別取處于對數(shù)生長期的上述細胞，調(diào)整細胞濃度為約6×103個/每孔，接種于96孔板中，每孔200μL，體積分數(shù)5%CO2、37℃、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液后，實驗組加入RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的蘆丁鍺至終濃度分別10、100μmol/L，溶劑對照組加入完全培養(yǎng)基，每孔終體積為200μL，每組設6個復孔。培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下形態(tài)學觀察并照相。再加入5 g/LMTT 20μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液后加入DMSO 150μL/孔，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長處各孔光密度值(OD值)，記錄結(jié)果。細胞生長抑制率(GI)按以下公式計算:

GI=1－(藥物組OD值/對照組OD值)×100%

1．4 清除DPPH自由基實驗

溶液的配制:1×10-4mol/L的DPPH·溶液的配制:精密稱取10 mg DPPH·，置于250 mL容量瓶中，加入少量無水乙醇，待溶解后再用無水乙醇定容至刻度，混勻，避光，置于冰箱保存。

供試液的配制:精密取各樣品適量，以乙醇為溶劑，分別配制 100、80、60、40、20 mg/L 的待測溶液。

參照文獻［9］方法，有所改進，精確吸取不同濃度的樣品溶液1 mL，分別與3 mL 1×10-4mol/L的DPPH·溶液混合，避光放置30 min，在517 nm處測吸光度Ay。以相應溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為As，相應樣品溶液的吸光度為A0。DPPH·自由基清除活性按下式計算:

Ay–1mL樣品溶液與3mLDPPH·溶液混勻后的吸光度值

As–1 mL乙醇溶液與3 mLDPPH·溶液混勻后的吸光度值

A0–1 mL樣品溶液與3 mL乙醇溶液混勻后的吸光度值

［9］計算自由基半數(shù)清除率。

2 結(jié)果與討論

2．1 紫外光譜分析

蘆丁在359 nm和257 nm處有兩個吸收峰，分別屬于π→ π*(B環(huán))電子躍遷，和n→ π*(A環(huán))電子躍遷，分別對應兩個生色團:359 nm吸收帶由肉桂酰生色團產(chǎn)生，為Ⅰ帶;257 nm吸收帶由苯甲酰生色團產(chǎn)生，為Ⅱ帶。

圖2 蘆丁的紫外光譜特征Fig.2 UV-visible absorption spectrum of rutin

當蘆丁與鍺形成配合物后，由于鍺的作用使峰帶Ⅰ向紅移至385 nm，紅移了26 nm，而峰帶Ⅱ向紅移至270 nm。由于金屬離子與蘆丁螯合成環(huán)，使體系內(nèi)共軛體系增加，電子躍遷需要的能量較低，紫外吸收光譜向波長較長的方向移動。蘆丁鍺的UV紅移說明了配合物的形成。

圖3 蘆丁和蘆丁鍺的紫外光譜Fig.3 UV-visible absorption spectrum of rutin and the rutin-Ge complex

2．2 紅外光譜分析

紅外吸收光譜是經(jīng)過紅外光照射的化合物分子吸收部分紅外光后，產(chǎn)生分子振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷而形成的分子吸收光譜。紅外光譜是對分子結(jié)構(gòu)的客觀反映，圖譜中的吸收峰都對應著分子中化學鍵或者基團的各種振動，因此，每種化合物都有其特征的紅外光譜圖。

蘆丁分子主要官能團紅外吸收峰分別是:υC=O1655．03 cm-1;苯環(huán)骨架振動頻率 υC=C1603．69 cm-1，1504．96 cm-1;羥基 υ-OH3423．42 cm-1，υC-OH1361．52 cm-1［10］。

蘆丁鍺的IR分別是:υC=O1651．80 cm-1;苯環(huán)骨架振動頻率 υC=C1566．20 cm-1，1488．04 cm-1;羥基υ-OH3405．23cm-1。υC-OH1305．51 cm-1。蘆 丁 在1655．03 cm-1處有明顯的羰基(C=O)伸縮振動強吸收峰，而蘆丁鍺的吸收峰是1651．80 cm-1，這是由于蘆丁與鍺形成配位鍵后，使C=O鍵減弱，故相應吸收峰向低波數(shù)區(qū)位移。643．10 cm-1處有強吸收峰，這是Ge-O金屬鍵的特征吸收峰。這進一步證明在蘆丁鍺中有金屬鍵生成。

2．3 蘆丁鍺的氫譜

1H NMR譜是鑒定黃酮化合物的結(jié)構(gòu)類型、確定取代基的位置和進行結(jié)構(gòu)研究的有效方法。氫譜可以提供有關(guān)分子中不同種類氫原子的情況，如根據(jù)化學位移和偶合常數(shù)可以判斷有關(guān)氫原子的化學環(huán)境，每種不同環(huán)境下氫原子的數(shù)目以及每個氫原子相鄰的基團的結(jié)構(gòu)等。

1H NMR譜中氫原子的歸屬。蘆丁的氫譜:12.60(5-OH)，10．82(7-OH)，9．68(4'-OH)，9．42(3'-OH)，7．55(2'-H，5'-H，6'-H)，6．87(8-H)，6.40(6-H)［11］。蘆丁鍺的氫譜:12．77(5-OH)，8.50(3'-OH)，7．46(2'-H)，7．27(5'-H)，7．07(6'-H)，6．47(8-H)，6．35(6-H)。蘆丁鍺中 7-OH和4'-OH的氫消失，說明在此生成了新的化學環(huán)境。結(jié)合UV和IR圖譜，鍺離子很可能在這兩個位置形成了配位鍵。結(jié)合UV、IR、1H NMR分析，推測蘆丁鍺可能具有如下結(jié)構(gòu):

圖4 蘆丁鍺的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of the rutin-Ge complex

2．4 蘆丁鍺的熱分析

近年來，熱分析技術(shù)已經(jīng)在藥物分析領(lǐng)域里有了廣泛的應用。通過加熱化合物可引起其物理化學變化，伴隨放熱和吸熱的產(chǎn)生以及質(zhì)量的變化。而通過熱重分析，可以了解配合物的穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)。在靜態(tài)空氣氣氛，升溫速度為10℃/min，差熱量程為100μV，測定溫度范圍從室溫到700℃。

圖5 蘆丁鍺的TGFig.5 TG of the rutin-Ge complex

蘆丁鍺受熱過程中分為四個失重階段。首先，在30～256℃，TG曲線有個失重臺階，失重率為16．07%，對應于DSC上91．7℃出現(xiàn)一個小的吸熱峰，說明了蘆丁鍺分子結(jié)構(gòu)中配位水的存在。從256℃開始，TG曲線又呈現(xiàn)出一個失重臺階，失重率為18．13%，對應DSC上323．2℃出現(xiàn)一個放熱峰;從400℃到630℃，TG曲線陡峭，失重率為45.27%，對應DSC上496．8℃出現(xiàn)放熱峰;這兩個階段是蘆丁鍺的分解，630℃以后，TG/DSC曲線趨于平穩(wěn)，推測蘆丁鍺分解完全。至此，蘆丁鍺的總失重率為79．47%，由于加熱過程在空氣氣氛中進行，因此最后殘渣剩余量20．53%應為GeO2。由此可計算出蘆丁鍺中鍺所占的百分比為14．25%。而根據(jù)圖6所推測的分子結(jié)構(gòu)，我們可以計算出鍺的理論含量為14．12%。這進一步佐證了圖6所推測的結(jié)構(gòu)。

圖6 蘆丁鍺的DSCFig.6 DSC of the rutin-Ge complex

2．5 蘆丁鍺體外清除DPPH自由基的作用

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液在517 nm處有最大吸收，當有自由基清除劑存在時，由于DPPH自由基的單電子被配對，從而使得在517 nm處的吸光度減小，因此該法常被用來評價樣品的抗氧化能力。從圖9可見，蘆丁和蘆丁鍺對DPPH自由基的清除活性均呈劑量依賴性，且蘆丁鍺對DPPH自由基的清除能力明顯強于蘆丁。根據(jù)實驗結(jié)果，蘆丁鍺與蘆丁的EC50分別是55．84 mg/L和58．95 mg/L，進一步說明蘆丁在與鍺配位后，其清除DPPH自由基能力增強，這可能與形成的配合物后，分子的共軛體系增大有關(guān)。

圖7 蘆丁鍺對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of the rutin-Ge complex on DPPH radical

黃酮類化合物的抗氧化能力取決于其特殊的分子結(jié)構(gòu)。蘆丁的抗氧化活性主要歸功于B環(huán)的3'-OH和4'-OH，可與鍺配位形成穩(wěn)定的五元環(huán)結(jié)構(gòu)，由于配合物的共軛體系增大，更易于發(fā)生氧化還原反應，捕獲自由基的電子，并提供H原子給DPPH，使其生成穩(wěn)定的DPPHH，從而發(fā)揮抗氧化作用，氧化機理見圖10。

圖8 蘆丁鍺對DPPH自由基的清除作用機理Fig.8 DPPH radical scavengingmechanism of the rutin-Ge complex

2．6 抗腫瘤實驗

采用MTT法測定蘆丁鍺的抗腫瘤活性，選取10 μM和100μM的蘆丁鍺分別作用于人子宮頸癌Hela細胞、肺癌SPC-A-1細胞、人食管癌EC9706細胞，考察其對癌細胞的增殖抑制作用。隨著蘆丁鍺濃度的增加，與空白對照組相比，給藥組細胞的形態(tài)變化不明顯，細胞生長良好，具有腫瘤細胞的一般特征。結(jié)果表明，蘆丁鍺(100μM)對人子宮頸癌Hela細胞、肺癌SPC-A-1細胞、人食管癌EC9706細胞均無明顯的抗腫瘤作用(P＞0．01)。

3 結(jié)論

蘆丁可以與氧化鍺在堿性條件下形成蘆丁鍺配合物，通過核磁、紫外、紅外圖譜及差熱分析，進一步論證了蘆丁鍺配合物的結(jié)構(gòu)。清除自由基實驗表明，蘆丁鍺較蘆丁具有更好的活性。體外抗腫瘤活性實驗表明，蘆丁鍺對 Hela細胞、SPC-A-1細胞、EC9706細胞的增殖均無明顯抑制作用。

參考文獻

1 Tian X，Li FJ，Zhu L，et al．Study on the electrochemical behavior of anticancer herbal drug rutin and its interaction with DNA．JElectroanal Chem，2008，621:1-6．

2 Viskupicova J，Danihelova M，Ondrejovic M，et al．Lipophilic rutin derivatives for anti-oxidant protection of oil-based foods．Food Chem，2010，123:45-50．

3 GhiasiM，Herav MM．Quantum mechanical study of antioxidative ability and antioxidative mechanism of rutin(vitamin P)in solution．Carbohydr Res，2011，346:739-744．

4 ZhaiGY(翟廣玉)，Xue HZ(薛華珍)，Zhou Q(鄒祺)．Progress in the study of rutin complex．Chem Reag(化學試劑)，2007，29:463-468．

5 Petkovic M，Vujacic A，Schiller J，et al．Application of flavonoids-quercetin and rutin-as new matrices formatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometric analysis of Pt(II)and Pd(II)complexes．Rapid Comm Mass Spectrom，2009，23:1467-1475．

6 Dorota N，Anna K，Maria M．Solid complexes of iron(II)and iron(III)with rutin．Struc Chem，2010，21:323-330．

7 Chen TJ，Lin CH．Germanium:environmental pollution and health effects．Environ Sci Pollut Res Int，2011，2:927-933．

8 Dehghan G，Khoshkam Z．Tin(II)-quercetin complex:synthesis，spectral characterization and antioxidantactivity．Food Chem，2012，131:422-426．

9 FotiMC，Daquino C，DiLabio GA，etal．Kinetics of the oxidation of quercetin by 2，2-diph-enyl-1-picrylhydrazyl(dpph·)．Org Lett，2011，13:4826-4829．

10 UivarosiV，Barbuceanu SF，Aldea V，etal．Synthesis，spectral and thermal studies of new rutin vanadyl complexes．Molecules，2010，15:1578-1589．

11 Ahmedova A，Paradowska K，Wawer I．1H，13C MAS NMR and DFT GIAO study of quercetin and its complex with Al(III)in solid state．J Inorg Biochem，2012，110:27-35．