丹參提取物中酚酸類含量的快速檢測法

勵(lì) 娜，胡 榮，蔣成英，楊榮平，張小梅

重慶市中藥研究院，重慶400065

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge．的干燥根及根莖。性微寒味苦，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。用于胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛［1］。丹參藥材中主要含脂溶性和水溶性成分。其中水溶性成分主要為丹酚酸類化合物，如丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸等，具有改善微循環(huán)、抗血栓、促進(jìn)組織恢復(fù)等作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，丹參酚酸類成分能夠縮小心肌梗死的范圍，減輕其病情，對大鼠心肌缺血、再灌注損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)有明顯的抑制血小板聚集、抗凝、溶纖及降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［2］。

《中國藥典》2010年版(一部)丹參項(xiàng)下收載用HPLC法測定丹酚酸B的含量標(biāo)準(zhǔn)，測定時(shí)間在20 min以上，只能測定丹酚酸B單一組分的含量，不利于丹參藥材水提物的整體質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硝酸鋁絡(luò)合顯色原理，采用紫外分光光度法測定丹參提取物中酚酸類的含量，并對方法的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明該含量測定方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，大大縮短了丹酚酸含量測定時(shí)間，提高了丹參藥材質(zhì)量檢測的效率，為丹參藥材及其水提物質(zhì)量控制提供了有效方法。

1 儀器與材料

UV-1601紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司);BUG25-12超聲波清洗機(jī)［220 W，50 KHz，必能信超聲(上海)有限公司］;數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司);AEG-45SM電子天平(十萬分之一，日本島津公司);BP121S電子天平(萬分之一，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。丹參藥材提取物(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，批號:090927);丹酚酸B對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，批號:115939-258A0056)。試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 對照品溶液與供試品溶液的制備

2．1．1 對照品溶液的制備

稱取丹酚酸B對照品1．6 mg，置于10 mL容量瓶中，精密稱定，加入75%甲醇溶解并定容至刻度。即得每1 mL含0．16 mg的丹酚酸B對照品溶液。

2．1．2 供試品溶液的制備

取丹參提取物粉末約0．02 g，精密稱定，加沸水使溶解，冷卻后定容于25 mL容量瓶，搖勻，作供試品溶液。

2．2 測定波長的選擇

取對照品溶液和供試品溶液5 mL，分別置于25 mL量瓶中，順序加入 5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5 mL、NaOH 試液 15 mL，加水至刻度，搖勻，放置5 min后，在400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，二者在482 nm有最大吸收，故選擇482 nm為測定波長。

2．3 分光光度法條件篩選

2．3．1 5%NaNO2用量考察

取供試品溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，分別加入 5%NaNO20、1、3、5、10、13 mL，再加入 10%Al(NO3)30．5 mL和NaOH試液5 mL，加水至刻度，搖勻，放置5 min后，在482 nm波長處測定其吸光度分別為 0．074、0．330、0．441、0．398、0．438、0．432。結(jié)果表明，5%NaNO2用量在3 mL時(shí)樣品吸光度較高，故5%NaNO2用量選擇在3 mL為宜。

2．3．2 10%Al(NO3)3用量考察

取供試品溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO23 mL后，分別加入10%Al(NO3)30、0.1、0．5、1、3 mL，再加入 NaOH 試液 5 mL，加水至刻度，搖勻，放置5 min后，在482 nm波長處測定其吸光度分別為 0．065、0．431、0．469、0．522、0．511、0.478。結(jié)果表明，10%Al(NO3)3用量在0．5 mL時(shí)樣品吸光度較高，故10%Al(NO3)3用量選擇在0．5 mL為宜。

2．3．3 NaOH 試液用量考察

取供試品溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5 mL 后，分別加入 NaOH 試液0、1、5、10、15 、16 mL，加水至刻度，搖勻，放置5 min后，在482 nm波長處測定其吸光度分別為 0．164、0．358、0．496、0．511、0．550、0．551。結(jié)果表明，NaOH試液用量在15 mL和16 mL時(shí)樣品吸光度均較高，同時(shí)吸光度值相差不大，故NaOH試液用量選擇在15 mL為宜。

2．3．4 顯色時(shí)間的考察

取供試品溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5mL 和 NaOH 試液15 mL，加水至刻度，搖勻，分別在 0、3、5、10、20、30 min后，在482 nm波長處測定其吸光度分別為0.522、0．522、0.521、0．517、0．515、0．514。結(jié)果表明，在放置5 min內(nèi)吸光度值較高且穩(wěn)定，5 min后吸光度值開始下降較明顯，故選擇的顯色時(shí)間為5 min。

2．4 線性關(guān)系考察

精密移取對照品溶液 0．5、1、2、4、6、6．5 mL，分別置于25 mL量瓶中，順序加入5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5 mL、NaOH 試液 15 mL，加水至刻度，搖勻，放置5 min后，于482 nm波長下測定吸光度。以丹酚酸B的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)、吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=0.8071X+0．0427(r=0．9977)。結(jié)果表明，丹酚酸B含量在0．0782～1.0166 mg范圍內(nèi)，吸光度值與含量線性關(guān)系良好。

2．5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取丹酚酸B對照品溶液(0．16 mg/mL)5 mL于25 mL容量瓶中，按2．4中顯色條件操作，經(jīng)放置顯色后，于482 nm波長處測定吸光度，連續(xù)6次，RSD值為0．009%，表明儀器精密度較好。

2．6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2．6．1 對照品穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取丹酚酸B對照品溶液(0．16 mg/mL)5 mL于25 mL容量瓶中，按2．4中顯色條件顯色后，分別在 0、0．5、1、1．5、3、4、8、12、24 h 測定其在 482 nm波長處的吸光度。吸光度平均值為0．668，RSD值為1.57%。結(jié)果表明，對照品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2．6．2 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取丹參提取物粉末約0．02 g，精密稱定，按2.1．2項(xiàng)下制得供試品溶液，取供試品溶液5 mL，按2．4 中顯色條件顯色后，分別在 0、0．5、1、1．5、3、4、8、12、24 h測定其在482 nm波長處的吸收度。樣品24 h內(nèi)總酚酸含量平均值為19．553%，RSD值為3.26%;12 h內(nèi)丹酚酸含量平均值為19．718%，RSD值為1．66%，表明供試品溶液在顯色后12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取丹參提取物粉末約0．025 g，精密稱定，5份，按2．1．2項(xiàng)下制得供試品溶液，分別取供試液5 mL，按2.4中顯色條件顯色后，測定其在482 nm波長處的吸收度。計(jì)算丹酚酸的含量平均值為19.416%，RSD值為1．18%，表明實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2．8 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的丹參提取物6份，精密稱定。按樣品中丹酚酸含量的80%、100%、120%精密加入對照品，按2．1．2項(xiàng)下制得供試品溶液，分別取供試液5 mL，按2．4中顯色條件顯色后，測定其在482 nm波長處的吸收度。計(jì)算回收率為101.652%，RSD值為0．81%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 1 Results of recovery test(n=9)

2．9 樣品的含量測定

按擬定含量測定方法對丹參藥材提取物3批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中含量測定結(jié)果Table 2 Content of salvianolic acid determined in 3 batches’sample

3 討論

本實(shí)驗(yàn)測定法較用HPLC法測定丹酚酸B單一成分含量更快速、簡便，同時(shí)對丹參藥材水溶性大類成分的控制也更為準(zhǔn)確、可靠。同時(shí)，可根據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果，將顯色劑組合開發(fā)為測定試紙等快速測定用產(chǎn)品，用于含鄰二酚羥基的酚酸類化合物的測定。對藥材的種植、加工、炮制等各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制具有非常重要的開發(fā)利用價(jià)值。

丹參藥材中酚酸類成分含量約為10%～13%［3］，而本實(shí)驗(yàn)測定含量在19% ～20%，原因在于本實(shí)驗(yàn)測定的是丹參水溶提取物中酚酸類成分的含量，理應(yīng)比丹參藥材中酚酸類成分的含量高，實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旆椒ǖ目尚行浴?/p>

丹酚酸類成分受熱見光均不穩(wěn)定、易氧化，故樣品制備好后應(yīng)及時(shí)檢測。同時(shí)，應(yīng)注意樣品的避光低溫保存。

本法簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可用于丹參藥材及提取物的質(zhì)量控制。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會(huì))．Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典)．Beijing:China Medical Science Press，2010，Vol I．70．

2 Gao X(高霞)，Wang ZM(王著明)，Wen SJ(溫守儉)．Different water extraction and alcohol precipitation process for the purification of salvianolic acid process．Jilin Med J(吉林醫(yī)學(xué))，2009，30:614-615．

3 Ye Y(葉勇)．Comparative study on determination of salvianolic acids content by colorimetery and HPLC．J Zhejiang Univ Tradit Chin Med(浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2006，30:350-351．