酶法制取低熱量大豆功能性油脂的研究

高向陽，孫樹坤，李博群，富校軼，3，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030；3.吉林醫(yī)藥學院，吉林吉林 132013）

油脂不僅能賦予食品獨特的口感和風味，同時也能提供人體所需的能量。但油脂的過量攝入嚴重損害了人類的健康[1]。因此開發(fā)一種具有同天然油脂功能性相似，熱量低，穩(wěn)定性好的新型油脂產(chǎn)品已經(jīng)成為油脂行業(yè)研究的熱點[2]。

現(xiàn)階段對低熱量油脂的研究主要是利用脂肪酶催化油脂改性，以中鏈脂肪酸與各種菜籽油、葵花油作為反應基質制取所需的功能性油脂產(chǎn)品[3]，如陳翔等[4]以菜籽油和辛酸為原料，在無溶劑體系中酶解合成結構脂質，結果辛酸合成率達40%。張鳳秀等[5]以豬胰腺脂肪酶為催化劑合成辛酸辛酯，使辛酸的轉化率達到98.12%。李新舟等[6]研究了不同條件下脂肪酶催化大豆油與辛酸甲酯的酯交換反應工藝條件。丁雙等[7]研究了固定化脂肪酶催化大豆油與辛酸酶解制備結構脂質的工藝，結果辛酸的插入率為43%。

大豆油在全球的生產(chǎn)和消費量都很高，大豆油中含有維生素E、亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，其脂肪酸構成比較適合人體消化吸收，在人體內起著重要的生理作用[8]。因此以大豆油為反應的基質在我國有很大的應用空間和發(fā)展?jié)摿?。短鏈脂肪酸（C2～C6）易揮發(fā)、分子量小、水中溶解度高、脂肪酸鏈短，在胃中吸收速度比中鏈脂肪酸快，并且短鏈脂肪酸合成的結構脂質熱量值低且具有降低膽固醇的功效[9]。因此本研究主要應用酶解法[10-12]，以脂肪酶為催化劑，在非水介質中通過短鏈脂肪酸丙酸酶解反應對大豆油進行改性，制備高附加值的低熱量功能性油脂，探討了在非溶劑體系中，酶添加量、底物摩爾比、反應溫度、反應時間等因素對丙酸插入率的影響，從而確定最佳的反應工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金龍魚大豆油（一級大豆油） 沃爾瑪超市；固定化1，3定向脂肪酶Lipozyme RM IM（507.2U/g）、Lipozyme TL IM（358.7U/g） 丹麥Novozyme公司；正丙酸（99%） 天津市光復精細化工研究所；脂肪酸標樣 Sigma公司；正己烷等其他有機溶劑和試劑 均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

HZS-Hx型水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Z36HK型低溫高速離心機 Germany；HH-4型田瑞數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠；氣相色譜儀 美國安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 結構脂質的制備及純化 采用無溶劑體系，稱取10.00g的大豆油與丙酸置于一具塞100mL三角瓶中，加入6%（以底物的質量計）脂肪酶，將其放入恒溫水浴振蕩器中，保持80r/min振蕩速率和60℃溫度，反應6h后終止，過濾除去脂肪酶，將反應混合物置于錐形瓶中，加入2～3滴1%酚酞溶液，結合計算所得的理論加堿量，使用KOH溶液滴定，滴至微紅色。再加入25mL熱水（水化）洗滌。取上層油脂層，經(jīng)烘箱干燥后離心，最后取上清液放入-4℃冰箱以備分析。

1.2.2 脂肪酶的選擇方法 選用Li-pozyme TL IM、Li-pozyme RM IM兩種固定化1-3定向脂肪酶，篩選方法為：稱取10.00g大豆油，按照2∶1（丙酸/大豆油，摩爾比）的底物比加入丙酸，再加入6%的脂肪酶（以底物質量計），在振蕩速率80r/min和一定的溫度條件下，將樣品放入水浴振蕩器中，反應2h后，按照1.2.1的實驗方法，得到的產(chǎn)物放入-4℃冰箱以備分析。

1.2.3 酶法制取低熱量油脂的單因素實驗方法

1.2.3.1 酶解溫度的確定 稱取10.00g的油脂，在底物比2∶1（丙酸/大豆油，摩爾比），酶用量6%，反應時間6h的條件下，按照1.2.1的實驗方法。觀察40、50、60、70和80℃五個溫度梯度對丙酸插入率的影響。以確定最佳的反應溫度范圍。

1.2.3.2 酶解時間的確定 稱取10.00g的油脂，在底物比2∶1（丙酸/大豆油，摩爾比），酶用量6%，反應溫度60℃的條件下，按照1.2.1的實驗方法。觀察2、4、6、8和10h五個時間梯度對丙酸插入率的影響。以確定最佳的反應時間范圍。

1.2.3.3 酶添加量的確定 稱取10.00g的油脂，在底物比2∶1（丙酸/大豆油，摩爾比），反應溫度60℃，反應時間8h的條件下，按照1.2.1的實驗方法。觀察2%、4%、6%、8%和10%五個酶添加量梯度對丙酸插入率影響。以確定最佳的酶添加量范圍。

1.2.3.4 底物摩爾比的確定 稱取10.00g的油脂，在反應溫度60℃，酶用量6%，反應時間8h的條件下，按照1.2.1的實驗方法。觀察2∶1、3∶1、4∶1、5∶1和6∶1五個底物摩爾比梯度對丙酸插入率的影響。以確定最佳的底物摩爾比范圍。

1.2.4 響應面優(yōu)化實驗 采用二次回歸正交旋轉組合設計方法設計四因素三水平實驗。以溫度、時間、底物比、加酶量四個因素為自變量，丙酸插入率為響應值。實驗因素水平編碼值見表1。實驗結果采用Design Expert 7.1軟件進行分析。

1.3 分析方法

1.3.1 甲酯化方法 稱取約50mg已制備好的低熱量功能性油脂于10mL具塞試管中，用移液管取1mL KOH-甲醇水溶液（13.1g/100mL）利用快速混勻器混勻，再取5mL正己烷振蕩30s，靜置放置澄清后，即可取上層清液進行GC分析。

表1 四因素三水平實驗編碼表Table 1 Four factors three levels test code table

1.3.2 氣相色譜分析條件 a.CP-Sil 88毛細管柱（100m×0.25mm×0.2μm，美國安捷倫）。b.進樣量1μL，進樣溫度260℃，分流比20∶1，柱壓力20cm/sec。c.程序升溫：柱箱平衡1min，140℃保留5min，然后以4℃/min的升溫速率將溫度升至220℃并保持25min，再以10℃/min的速率將溫度升至230℃并保持5min。d.檢測器：氫焰離子化檢測器（FID），260℃，氫氣流量40mL/min、空氣流量400mL/min、氮氣流量30mL/min。

然后調整柱箱的初始溫度和載氣的線速度直到能較好的檢測出結果以確定最終的色譜條件。

1.3.3 丙酸插入率的計算 丙酸插入率（丙酸含量）=結構脂質甲酯化后丙酸甲酯的面積百分含量/結構脂質甲酯化后所有脂肪酸甲酯的面積百分含量總和。

1.3.4 油脂的熱分析——氧彈法 先稱取約1.000g已制備好的低熱量功能性油脂，放入熱量計氧彈內，然后向其沖入約3MPa的氧氣，再將氧彈放在一個盛有約2L足夠浸沒氧彈的水桶中，并使氧彈內的物質點火燃燒，放出的熱量被桶中的水吸收并使水溫升高，根據(jù)升溫程度計算油樣的熱值。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶的選擇

在酶解反應體系中為了篩選出催化活性較高的脂肪酶，分別選用兩種不同的脂肪酶Li-pozyme TL IM和Li-pozyme RM IM在不同的溫度梯度下進行酶解比較。

圖1 兩種脂肪酶催化活力比較Fig.1 Different lipases catalyses ability comparison

由圖1可知，兩種脂肪酶都有較好的催化效率，但在不同的反應溫度下卻呈現(xiàn)出了明顯的變化趨勢，Lipozyme RM IM脂肪酶催化酶解所制備的低熱量功能性油脂中丙酸的插入率較高，因此在后續(xù)的實驗中選用Lipozyme RM IM做催化劑。

2.2 影響酶法制取低熱量功能性油脂的單因素實驗研究

2.2.1 溫度對酶解反應的影響 由圖2可知，在非溶劑體系中，隨著反應溫度的升高，可加速酶解反應使結合到甘油骨架上的丙酸含量增加，而其他脂肪酸含量也相應的有所變化，當溫度從40℃上升到60℃時，大豆油中丙酸含量明顯增大，溫度超過70℃以后，丙酸含量逐漸減小。其原因主要為隨溫度升高，反應體系的粘度、傳質阻力變小增加反應速率。但繼續(xù)升溫，酶易失活而發(fā)生變性，致使酶活力降低。因此在本研究的優(yōu)化設計中，將酶解溫度選為50～70℃。

圖2 溫度對酶解反應的影響Fig.2 Effects of temperature on enzymolysis reaction

2.2.2 時間對酶解反應的影響 由圖3可知，在反應初期，改性油脂中丙酸含量呈增加趨勢，但反應到一定階段后，產(chǎn)物中丙酸含量變化趨于緩和，反應體系最終達到平衡。如果繼續(xù)延長反應時間不但增加了丙酸位移，也沒有實際意義。因此在優(yōu)化設計中，選取時間為6～8h。

圖3 時間對酶解反應的影響Fig.3 Effects of time on enzymolysis reaction

2.2.3 脂肪酶用量對酶解反應的影響 由圖4可知，在酶添加量由2%增至8%的過程中，改性油脂中丙酸含量增加速率較快。當酶用量繼續(xù)增加時，反應體系中丙酸含量增加幅度減小，最后接近平衡。其原因可能為反應初期，底物與酶分子接觸機會增多，酯交換頻率增大，產(chǎn)物中丙酸含量增加。反應一段時間后，由于底物含量減少，并且底物與產(chǎn)物對酶的傳質阻率增大，使得產(chǎn)物中丙酸含量減小。此外考慮到酶價較高。所以選取酶添加量的較佳區(qū)域為6%～10%。

圖4 脂肪酶用量對酶解反應的影響Fig.4 Effects of enzyme load on enzymolysis reaction

2.2.4 底物摩爾比對酶解反應的影響 由圖5可知，當丙酸/大豆油的摩爾比從2∶1上升到3∶1時，丙酸含量增加的較快，當?shù)孜锉壤^3∶1，丙酸含量增加緩慢并呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能為丙酸的初始濃度大有利于大豆油中丙酸含量的增加。因此在后面的優(yōu)化實驗中，底物比選用2∶1～4∶1。

圖5 底物摩爾比對酶解反應的影響Fig.5 Effects of substrate molar ratio on enzymolysis reaction

2.3 響應面實驗結果

根據(jù)表1實驗因素和水平的設計，進行29個實驗點，其中24個為析因實驗點，5個中心實驗點，優(yōu)選最佳提取工藝。

對表2在不同條件下所測得的丙酸插入率，利用Design expert 7.1軟件進行回歸擬合，得到丙酸插入率的回歸方程：

Y=14.64+1.69X1+1.12X2+1.08X3+0.26X4+1.16X1X2-0.29X1X3+0.67X1X4-0.0075X2X3+1.62X2X4+0.21X3X4-2.10X12-4.90X22-2.03X32-2.05X42

2.3.1 模型方差分析 利用Design expert 7.1統(tǒng)計軟件進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析和回歸方程系數(shù)估計值，見表3。

回歸方程中各變量對指標（響應值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率p的值越小，則響應變量的顯著性越高。由表3可知，四個因素對丙酸插入率的影響順序為：酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間＞底物摩爾比。從方差分析可以看出模型Prob＞F小于0.01，表明該模型方程高度顯著，不同處理間的差異高度顯著。模型失擬項的Prob＞F值0.6898＞0.05，模型失擬項不顯著，模型選擇合適。由此可見，各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。相關系數(shù)R2=257.74/262.82=0.981，R2adj=0.9613說明丙酸插入率實際值與預測值之間具有較好的擬合度，因此該模型可用于預測響應值丙酸插入率Y的實際情況。

表2 Box-behnken設計方案及實驗結果Table 2 Box-behnken design plan and experimental results

2.3.2 響應曲面分析與最優(yōu)工藝條件的確定 根據(jù)回歸分析結果，做出響應曲面圖，如圖6～圖11。從響應曲面分析圖中可以找到最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的交互作用。

如圖6～圖11直觀地反映了各因素對響應值的影響。比較6組圖可知，酶解溫度、酶添加量、酶解時間和底物比對丙酸插入率的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。丙酸插入率的響應面趨勢呈拋物線形，因此回歸方程有極大值，結合方程與響應曲面可得到酶法制取低熱量大豆功能性油脂的最優(yōu)參數(shù)為：酶解溫度64.4℃，酶添加量8.4%，酶解時間8.8h，底物比

圖6 酶添加量與酶解溫度的交互作用Fig.6 The interaction of enzyme additives and enzymolysis temperature

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖7 底物比與酶添加量的交互作用Fig.7 The interaction of substrate ration and enzyme additives

圖8 酶解時間與酶解溫度的交互作用Fig.8 The interaction of enzymolysis time and enzymolysis temperature

圖9 酶解時間與酶添加量的交互作用Fig.9 The interaction of enzymolysis time and enzyme additives

圖10 底物比與酶解溫度的交互作用Fig.10 The interaction of substrate ration and enzymolysis temperature

3.3 ∶1，丙酸插入率為15.26%。

根據(jù)最佳工藝條件，做三組驗證性實驗，結果如表4所示。

圖11 底物比與酶解時間的交互作用Fig.11 The interaction of substrate ration and enzymolysis time

表4 最佳工藝條件驗證結果Table 4 Verify results of the best process conditions

由表4可以看出，在所得的最佳工藝條件下丙酸插入率與預測值接近，因此進一步驗證了實驗結果。

2.4 低熱量功能性油脂的熱分析

采用1.3.4所述方法測定油脂產(chǎn)生的熱值，得到原大豆油的熱值為39.96MJ/kg。

圖12 低熱量功能性油脂熱值與丙酸插入率的關系Fig.12 Relationship betwee low calorie functional oil and propionic acid insertion rate

由圖12可知，在所有被測的低熱量功能性油脂中，熱值最低的為32.57MJ/kg，與原大豆油相比熱值降低了約18.5%。

3 結論

本研究以大豆油與丙酸為反應基質，通過篩選在非溶劑體系中以Lipozyme RM IM固定化1-3定向脂肪酶做催化劑制備低熱量功能性油脂，利用安捷倫氣相色譜儀測定低熱量功能性油脂的脂肪酸組成。在單因素以及四因素三水平的響應面法實驗基礎上，建立了響應值和各因素之間的數(shù)據(jù)模型。四個因素對丙酸含量的影響順序為：酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間＞底物摩爾比。確定了酶法制取低熱量大豆功能性油脂的最佳工藝參數(shù)：酶解溫度64.4℃，酶解時間8.8h，酶添加量8.4%，底物摩爾比3.3∶1。在此條件下低熱量功能性油脂的理論丙酸插入率為15.26%。驗證值可達14.85%。

通過產(chǎn)品的熱分析圖可知，大豆油中丙酸的插入起到了降低油脂熱量的功效，低熱量功能性與原大豆油相比熱量值降低了約18.5%。

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