張正健,韓雨彤,陳蘊(yùn)智,胡惠仁
(1. 天津科技大學(xué)包裝與印刷工程學(xué)院,天津 300222;2. 天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,天津 300457)
里氏木霉(Trichoderma reesei)DWC11,天津科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;思茅松 BKP,云南云景林紙股份有限公司提供.羧甲基纖維素鈉(CMC)、無(wú)水葡萄糖、乙酸鈉、硫酸鎂、冰醋酸、硫酸錳、鹽酸、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、氫氧化鈉、硫酸、亞硫酸氫鈉、苯酚、氯化鈷、氯化鈣、氯化鋅、氯化鉀、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、微晶纖維素、蔗糖、麥芽糖、麩皮、麥稈粉、檸檬酸鈉、檸檬酸、水楊素,市售.
恒溫培養(yǎng)箱,江蘇正基儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī),日本日立公司;高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計(jì),LabTech公司;Valley打漿機(jī),陜西科技大學(xué)機(jī)械廠;真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;PFI磨,挪威制漿造紙研究院;肖伯氏打漿度儀,宜賓造紙廠;快速紙頁(yè)成形器,EStanit Gbmh公司;抗張強(qiáng)度測(cè)試儀、撕裂度測(cè)試儀、耐破度測(cè)試儀,Lorentzen & Wettre公司.
1.2.1 培養(yǎng)基
里氏木霉試管斜面培養(yǎng)基:1,g CMC、4,g營(yíng)養(yǎng)元素液、0.1,g微量元素液、2,g瓊脂,加入蒸餾水至總質(zhì)量為 100,g,pH 6.0.里氏木霉種子發(fā)酵培養(yǎng)基:1,g葡萄糖、4,g營(yíng)養(yǎng)元素液、1,g麩皮、0.1,g微量元素液,加入蒸餾水至總質(zhì)量為100,g,pH 5.5~6.0.里氏木霉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:1,g麩皮、4,g營(yíng)養(yǎng)元素液、0.2,g微量元素液、1,g碳源,加入蒸餾水至總質(zhì)量為100,g.
1.2.2 相關(guān)溶液的配制
營(yíng)養(yǎng)元素液:6.25,g檸檬酸鈉、12.5,g磷酸二氫鉀、5,g硫酸銨、1,g硫酸鎂和 0.5,g氯化鈣溶解后定容至100,mL.微量元素液:2.5,g硫酸亞鐵、0.98,g硫酸錳、0.83,g氯化鋅、1,g氯化鈷和 5,mL 2,mol/L HCl溶解后定容至100,mL.
在溫度 30,℃、搖床轉(zhuǎn)速 120,r/min條件下培養(yǎng)96,h,通過(guò)改變氮源和碳源種類、碳源加入量、麩皮加入量、微量元素液加入量和營(yíng)養(yǎng)元素液加入量,以發(fā)酵粗酶液的吸光度為評(píng)價(jià)依據(jù),系統(tǒng)考察上述各種條件變化對(duì)纖維素酶各組分酶活的影響.在考察加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響時(shí),其加入量是相對(duì)于培養(yǎng)基總量(含自身)的質(zhì)量百分比.在一定溫度和 pH 條件下,1,mL酶液(1,g酶粉)每分鐘水解相應(yīng)底物產(chǎn)生 1,μg還原糖(以葡萄糖計(jì))的酶量定義為 1個(gè)酶活單位.濾紙酶活(FPA)表示酶的總體活性、Cx酶活表示內(nèi)切葡萄糖苷酶活性、C1酶活表示外切葡萄糖苷酶活性、Cb酶活表示 β-葡萄糖苷酶活性,對(duì)應(yīng)的降解底物分別為 1,cm×6,cm 的濾紙、1% CMC溶液、50,mg脫脂棉球和 1%水楊素溶液.取一定量稀釋酶液,與相應(yīng)底物反應(yīng)一定時(shí)間,反應(yīng)液經(jīng) DNS顯色,測(cè)定530,nm的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物)確定還原糖產(chǎn)生的量,從而確定出酶的活力,吸光度越大,表明酶活性越強(qiáng).通過(guò)改變酶用量,考察其對(duì)打漿性能和紙漿物理性能的影響,具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7].
2.1.1 氮源和碳源種類
1995年,建設(shè)部印發(fā)了《城市園林綠化企業(yè)資質(zhì)管理辦法》和《城市園林綠化企業(yè)資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》,將園林綠化企業(yè)自此從建工企業(yè)中分離。2007年,建設(shè)部印發(fā)了《工程設(shè)計(jì)資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》,又將風(fēng)景園林工程從市政公用行業(yè)脫離出來(lái)。2011年3月,風(fēng)景園林學(xué)被批準(zhǔn)為國(guó)家一級(jí)學(xué)科,與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)、建筑學(xué)形成三足鼎立之勢(shì),風(fēng)景園林行業(yè)的地位產(chǎn)生了巨大提升。但目前的城鄉(xiāng)園林綠化法規(guī)大多仍然設(shè)置在城市市政公用事業(yè)規(guī)體系之下,在生態(tài)文明建設(shè)日益重要的今天,缺乏一定的獨(dú)立性。
氮源和碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 1所示.由圖 1(a)可以看出,氮源不同對(duì)各組分酶活有顯著影響,無(wú)機(jī)氮源以硫酸銨為最佳,有機(jī)氮源以牛肉膏為最佳.產(chǎn)酶高低依次是硫酸銨>牛肉膏>硝酸銨>蛋白胨>酵母膏>尿素.以尿素為氮源,酶活很低,這是由于尿素使液體培養(yǎng)基的pH增加所致.硫酸銨所對(duì)應(yīng)的各組分酶活都較高,并且價(jià)格較低,原料易得,故采用硫酸銨為培養(yǎng)基的氮源.
從圖 1(b)中可以看出,固體碳源的產(chǎn)酶效果要比可溶性碳源好,這是因?yàn)槔w維素酶是誘導(dǎo)酶,受碳源種類的影響較大,纖維材料能夠產(chǎn)生更好的誘導(dǎo)效果.當(dāng)采用思茅松 BKP和微晶纖維素為碳源時(shí),各組分酶活都比以麥稈和堿處理麥稈為碳源時(shí)要高,這是因?yàn)辂湺捄蛪A處理麥稈的木素和半纖維素含量高,阻礙了里氏木霉菌體與纖維的接觸,因此其產(chǎn)纖維素酶活性較低.由于本發(fā)酵所制纖維素酶最終目的是用于思茅松 BKP的酶促打漿研究,所以為了能夠獲得針對(duì)性更強(qiáng)的纖維素酶,本研究采用思茅松 BKP為發(fā)酵碳源.
圖1 不同氮源和碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen and carbon sources on cellulase production
2.1.2 碳源加入量
碳源加入量對(duì)產(chǎn)酶影響較大,如果加入量過(guò)低,則不能夠提供菌體生長(zhǎng)所需要的碳源量;如果加入量過(guò)高,會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的固含量過(guò)高,不易搖動(dòng)起來(lái),從而導(dǎo)致溶氧量不足,菌體無(wú)法正常生長(zhǎng),最終使得產(chǎn)酶活性較低.碳源加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 2所示.
圖2 碳源加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source dosage on cellulase production
從圖 2中可以看出,當(dāng)思茅松 BKP加入量為0.5%~1%時(shí),F(xiàn)PA 和 C1酶活相對(duì)較高,當(dāng)思茅松BKP加入量大于1%時(shí),F(xiàn)PA和C1酶活明顯降低;當(dāng)思茅松BKP加入量為0.5%~3%時(shí),Cb和Cx酶活相對(duì)較高,當(dāng)思茅松 BKP加入量大于 3%時(shí),Cb和 Cx酶活迅速降低.這表明 FPA和 C1酶活受思茅松BKP加入量的影響較大,而Cb和Cx酶活受其影響較小.當(dāng)思茅松 BKP加入量為 1%時(shí),各組分酶活都達(dá)到最大值,因此本研究采用的思茅松 BKP加入量為1%.
2.1.3 麩皮加入量
麩皮加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 3所示.可以看出,當(dāng)麩皮添加量為 1%時(shí),各組分酶活均達(dá)到最大值,隨著其加入量的繼續(xù)增加,活力反而逐漸下降,這說(shuō)明麩皮添加量過(guò)大對(duì)發(fā)酵不利,因此在發(fā)酵過(guò)程中添加1%的麩皮來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)酶活力.
圖3 麩皮加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of bran dosage on cellulase production
2.1.4 微量元素液加入量
微量元素液含有 Fe2+、Mn2+、Zn2+和 Co2+,這些金屬離子在一定的濃度下對(duì)纖維素酶的合成以及酶活性有促進(jìn)作用,比如Fe2+離子在酶與底物之間起著連橋作用,從而更有利于底物與酶的活性中心必需基團(tuán)的結(jié)合.但是,如果上述離子濃度過(guò)大,則對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用.微量元素液加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 4所示.
圖4 微量元素液加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of microelement liquid dosage on cellulase production
從圖中可以看出,當(dāng)微量元素液用量為 0.2%時(shí),各組分酶活都達(dá)到最大,大于或小于 0.2%都對(duì)產(chǎn)酶不利,因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素液加入量為0.2%.
2.1.5 營(yíng)養(yǎng)元素液加入量
營(yíng)養(yǎng)元素液中包含發(fā)酵所必需的氮源(硫酸銨)、磷酸氫二鉀-檸檬酸鈉緩沖溶液、Mg2+和 Ca2+.由于微生物在代謝過(guò)程中不斷地向培養(yǎng)基中分泌代謝產(chǎn)物,影響培養(yǎng)基的pH變化,對(duì)大多數(shù)微生物來(lái)說(shuō),主要產(chǎn)生酸性產(chǎn)物,所以在培養(yǎng)過(guò)程中常引起 pH的下降,影響微生物的生長(zhǎng)繁殖速度.為了盡可能地減緩培養(yǎng)過(guò)程中 pH的變化,在配制培養(yǎng)基時(shí),加入一定的緩沖物質(zhì)可以起到調(diào)節(jié)pH的作用.營(yíng)養(yǎng)元素液中的鉀、鈣和鎂離子還參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成,并有能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞透性調(diào)節(jié)等功能.營(yíng)養(yǎng)元素液用量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖5所示.
圖5 營(yíng)養(yǎng)元素液用量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of nutrition element liquid dosage on cellulase production
由圖 5可知,隨著營(yíng)養(yǎng)元素液用量的增加,纖維素酶各組分酶活先上升后下降,在用量為 8%時(shí)均達(dá)到最高值.當(dāng)用量小于 8%時(shí),不能滿足菌體的生長(zhǎng)所需,但是用量過(guò)大時(shí)則對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用.因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素液加入量為8%.
在氮源(硫酸銨)0.2%、碳源(思茅松 BKP)1%、麩皮 1%、微量元素液 0.2%、營(yíng)養(yǎng)元素液 8%,溫度30,℃、搖床轉(zhuǎn)速 120,r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng) 96,h,其各組分酶活為:FPA 酶活 471.42,U/mL,Cx酶活3,083.19,U/mL,C1酶活 471.42,U/mL,Cb酶活為27.79,U/mL.通過(guò)改變酶用量,研究其在酶促打漿中的作用.
酶用量(按 FPA 酶活計(jì)算,下同)對(duì)紙漿打漿度和物理性能的影響見(jiàn)表 1.從中可以看出,在打漿時(shí)間均為 4,min的條件下,當(dāng)酶用量在 0~5,U/g之間時(shí),打漿度增加較平緩;酶用量大于5,U/g時(shí),打漿度明顯上升,酶用量為 7,U/g時(shí),打漿度比空白樣高出10,°SR.打漿度的增加是由酶解作用造成的.酶解作用使紙漿纖維細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)受到破壞,使纖維產(chǎn)生內(nèi)部和外部細(xì)纖維化,從而使其易于打漿.在相同打漿時(shí)間內(nèi),酶處理后的漿樣比空白樣的打漿度要高,酶用量越大提高程度越大,即在達(dá)到相同打漿度的情況下,酶處理后的漿樣能有效降低打漿時(shí)間,酶用量越大所需的打漿時(shí)間就越少,從而降低打漿能耗.
表1 酶用量對(duì)打漿和紙漿物理性能的影響Tab.1 Effect of cellulase dosage on beating degree and the pulp physical properties
在研究酶用量對(duì)紙漿物理性能的影響時(shí),空白樣和酶處理樣都需達(dá)到同一打漿度,即控制在48,°SR.紙漿的物理性能的變化是纖維間結(jié)合力、纖維內(nèi)在強(qiáng)度和纖維平均長(zhǎng)度綜合影響的結(jié)果.從表 1中可以看出,抗張指數(shù)只在酶用量為 5,U/g時(shí)略有增加;耐破指數(shù)和撕裂指數(shù)隨著酶用量增加都呈逐漸下降趨勢(shì),但下降的幅度都不大.因此,采用里氏木霉自制纖維素酶進(jìn)行酶促打漿,不僅能夠有效地提高打漿性能,而且還能夠最大程度地保持紙漿的強(qiáng)度性能,這對(duì)降低酶促打漿生產(chǎn)成本、推廣其工業(yè)化應(yīng)用具有一定實(shí)用價(jià)值.
里氏木霉發(fā)酵制備纖維素酶粗酶液的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下:氮源(硫酸銨)0.2%、碳源(思茅松BKP)1%、麩皮 1%、微量元素液 0.2%、營(yíng)養(yǎng)元素液8%,溫度 30,℃、搖床轉(zhuǎn)速 120,r/min,培養(yǎng) 96,h.隨著里氏木霉所制纖維素酶用量的增加,打漿度逐漸上升,思茅松 BKP的打漿性能得到明顯提高;紙漿的物理強(qiáng)度性能有所下降,但下降幅度不大.
[1] 張繼泉,王瑞明,孫玉英,等. 里氏木霉生產(chǎn)纖維酶的研究進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè),2003,24(1):9–13.
[2] Xu J,Nogawa M,Okada H,et al. Regulation of xyn3 gene expression in Trichoderma reesei PC-3–7 [J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2000,54(3):370–375.
[3] 胡彩靜,代淑梅,李秋園. 里氏木霉(Trichoderma reesei)產(chǎn)纖維素酶液態(tài)發(fā)酵條件的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(9):45–48.
[4] 楊博,秦夢(mèng)華,劉娜,等. 纖維素酶和木聚糖酶改善楊木 CTMP強(qiáng)度性能的研究[J]. 造紙科學(xué)與技術(shù),2010,29(2):59–63.
[5] 張正健,胡惠仁,徐建峰,等. 漂白硫酸鹽思茅松漿酶促打漿的研究[J]. 中國(guó)造紙學(xué)報(bào),2009,24(1):35–41.
[6] 劉姍姍,徐永建,王志杰,等. 纖維素酶處理對(duì)闊葉木漿打漿性能的影響[J]. 陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,27(6):29–31.
[7] 張正健,胡惠仁. 纖維素酶改性提高思茅松漂白KP漿打漿性能[J]. 中國(guó)造紙,2008,27(12):1–5.