碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻抗氧化能力的影響

于 濤，王曉燕，洪利亞，鐘韻山，徐仰倉(cāng)

(天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

海洋約占地球表面積的71%，蘊(yùn)藏著豐富的生物資源，由于高壓、高鹽、低營(yíng)養(yǎng)等特殊環(huán)境及海洋物種間的生態(tài)作用，再加上遺傳和代謝的特異性，使海洋生物產(chǎn)生多種不同于陸地生物的特殊產(chǎn)物．杜氏鹽藻是一種廣泛分布于海洋、鹽湖中的單細(xì)胞無(wú)壁的真核綠藻[1]，含有豐富的 β–胡蘿卜素、黃酮、甘油、維生素 E、亞麻酸、硒、葉酸、多糖等生理活性物質(zhì)[2]，具有提高人體免疫力、清除自由基、防治腫瘤、心血管、老年性癡呆和白內(nèi)障等疾病的功能[3]．不同培養(yǎng)條件下，杜氏鹽藻體內(nèi)的生理活性物質(zhì)含量差異很大．本文研究了含碘鹽培養(yǎng)下，杜氏鹽藻體內(nèi)主要生理活性物質(zhì)含量及清除自由基能力的變化，為提高杜氏鹽藻的藥用價(jià)值提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)方法

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種室．將杜氏鹽藻藻種接入本次實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)液中培養(yǎng)．

培養(yǎng)液：鹵水，取自塘沽鹽場(chǎng)，過(guò)濾后用蒸餾水稀釋鹽度至 30‰．一次性添加營(yíng)養(yǎng)鹽至下列濃度：NaNO30.4,mmol/L，尿素 0.2,mmol/L，KH2,PO40.1,mmol/L，檸檬酸鐵 0.01,mmol/L，NaHCO33.0,mmol/L．121,℃ 30,min 滅菌．培養(yǎng)溫度為 25,℃，光照度為 4,000,lx，光/暗周期為 16,L/8,D．培養(yǎng)時(shí)間為 10,d．處理組在培養(yǎng)初始加不同質(zhì)量濃度的碘酸鉀．

1.2 提取及測(cè)定方法

1.2.1 β–胡蘿卜素的提取及含量的測(cè)定

參照張建華等[4]使用的方法，稱取鹽藻粉 0.5,g，置于 250,mL三角瓶中，加入丙酮–石油醚(體積比為3∶7)100,mL，封口，60,℃水浴浸提 2次，每次60,min，離心分離上清液，合并提取液，減壓濃縮至25,mL．在450,nm處測(cè)吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量．

1.2.2 黃酮類化合物的提取及含量的測(cè)定

1.2.3 維生素E的提取及含量的測(cè)定

參照劉樹恒[6]使用的方法，用維生素E(Sigma公司，α–生育酚≥96)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．稱取鹽藻粉0.5,g，加入無(wú)水乙醇 50,mL，室溫浸提 60,min，9,200,r/min離心5,min，沉淀用50,mL無(wú)水乙醇再次提取60,min，合并提取液，減壓濃縮至25,mL．10,mL反應(yīng)體系中包括20,mg/L NH4Fe(SO4)2溶液0.5,mL、pH 4.6的乙酸–乙酸鈉緩沖溶液 1.0,mL、樣品溶液2.0,mL、5–硝基–1，10–菲咯啉乙醇溶液 1.0,mL、10.0,g/L十六烷基三甲基溴化銨溶液 1.0,mL、H2O 4.5,mL，室溫反應(yīng)10,min．在502,nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出維生素E含量．

采用核黃素–NBT還原法[7]．核黃素在光照下可以產(chǎn)生·，·可被 NBT 還原形成藍(lán)色物質(zhì)，后者在 580,nm處有吸光值．3,mL反應(yīng)體系中含有：提取液 0.1,mL，0.1,mol/L EDTA 0.2,mL，1.5,mmol/L NBT 0.1,mL，磷酸緩沖液(pH 7.8)2.55,mL，0.12,mmol/L核黃素 0.05,mL．25,℃下光照 10,min．在 580,nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定樣品組吸光度(A1)和對(duì)照組吸光度(A2)，按照式(1)計(jì)算清除率．

1.2.5 羥自由基(·OH)的測(cè)定

·OH 由 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，·OH 的測(cè)定采用水楊酸比色法，參照徐仰倉(cāng)[8]使用的方法．5,mL反應(yīng)體系中含有：10,mmol/L水楊酸 0.5,mL，0.4,mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)3.0,mL，或 0.4,mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.4)2.8,mL，提取液 0.2,mL，3.8,mmol/L Fe2+–EDTA溶液 0.5,mL，4,mmol/L H2O21,mL．25,℃反應(yīng) 90,min后，用乙醚抽提 2，3–二羥基苯甲酸，在 510,nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定樣品組吸光度(A1)和對(duì)照組吸光度(A2)，按照式(1)計(jì)算·OH清除率．

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用t–檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個(gè)數(shù)據(jù)是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻體內(nèi)黃酮含量的影響

碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻體內(nèi)黃酮含量的影響如圖 1所示．當(dāng)培養(yǎng)液中碘酸鉀的質(zhì)量濃度低于 2.0,g/L時(shí)，杜氏鹽藻體內(nèi)黃酮的含量并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化；當(dāng)培養(yǎng)液中碘酸鉀質(zhì)量濃度在 3.0～4.0,g/L時(shí)，杜氏鹽藻體內(nèi)的黃酮含量明顯高于對(duì)照；當(dāng)培養(yǎng)液中碘酸鉀質(zhì)量濃度為 4.0,g/L時(shí)，黃酮含量為對(duì)照的126.3%；當(dāng)?shù)馑徕涃|(zhì)量濃度為5.0,g/L時(shí)，黃酮的含量又基本回到對(duì)照水平．

圖1 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻黃酮含量的影響Fig.1 Effect of potassium iodate on flavonoid content in dunaliella salina

2.2 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻體內(nèi)β–胡蘿卜素含量的影響

碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻體內(nèi) β–胡蘿卜素含量的影響如圖 2所示．碘酸鉀誘導(dǎo)杜氏鹽藻 β–胡蘿卜素含量累積的最佳質(zhì)量濃度為 0.4,g/L，此時(shí)，β–胡蘿卜素含量為對(duì)照的121.6%．此后，隨著培養(yǎng)液中碘酸鉀質(zhì)量濃度的增高，藻體內(nèi)的 β–胡蘿卜素含量逐漸降低，碘酸鉀質(zhì)量濃度為 1.0,g/L時(shí)，β–胡蘿卜素含量為對(duì)照的96.8%．

圖2 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻β–胡蘿卜素含量的影響Fig.2 Effect of potassium iodate on beta-carotene content in dunaliella salina

2.3 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻體內(nèi)維生素E含量的影響

由圖 3可見：隨著碘酸鉀質(zhì)量濃度的升高，杜氏鹽藻體內(nèi)的維生素 E含量逐漸增高，碘酸鉀質(zhì)量濃度為 0.4,g/L時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的 126.7%．此后隨著碘酸鉀質(zhì)量濃度的增高，藻體內(nèi)的維生素 E含量反而降低，當(dāng)?shù)馑徕涃|(zhì)量濃度為1.0,g/L時(shí)，藻體內(nèi)的維生素E含量降為對(duì)照的94.7%．

圖3 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻維生素E含量的影響Fig.3 Effect of potassium iodate on vitamin E content in dunaliella salina

2.4 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻提取物清除 ·、·OH的影響

以上結(jié)果表明，培養(yǎng)液中碘酸鉀質(zhì)量濃度直接影響著杜氏鹽藻體內(nèi)抗氧化劑的含量，其中刺激作用較大的碘酸鉀質(zhì)量濃度為 0.4,g/L和 4.0,g/L．為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，檢測(cè)不同碘酸鉀質(zhì)量濃度下杜氏鹽藻提取液清除·、·OH 能力的變化．核黃素在光照下可以產(chǎn)生·．杜氏鹽藻藻粉提取液(50%乙醇提取液)能部分清除反應(yīng)體系中核黃素產(chǎn)生的·，清除率為 35.6%(圖 4)．杜氏鹽藻培養(yǎng)在含碘酸鉀的溶液中，其提取液清除的能力提高了．碘酸鉀質(zhì)量濃度在 0～1,g/L 時(shí)，藻體清除·的能力與體內(nèi) β–胡蘿卜素和維生素 E含量的變化趨勢(shì)一致，碘酸鉀質(zhì)量濃度為 0.4,g/L時(shí)，清除率最大，達(dá)到 59.8%(圖4)；碘酸鉀質(zhì)量濃度在 1～5,g/L時(shí)，藻體清除·的能力與體內(nèi)黃酮含量的變化趨勢(shì)一致，碘酸鉀質(zhì)量濃度為 4.0,g/L時(shí)，清除率最大，達(dá)到 52.9%(圖 4)．觀測(cè)碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻提取物清除·OH的影響時(shí)得到了類似的結(jié)果(圖5)．

圖4 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻提取物清除·能力的影響Fig.4 Effect of potassium iodate on the· free radical scavenging capacity of dunaliella salina extract

圖5 碘酸鉀對(duì)杜氏鹽藻提取物清除·OH能力的影響Fig.5 Effect of potassium iodate on the ·OH free radical scavenging capacity of dunaliella salina extract

3 討論與分析

已知杜氏鹽藻是一種重要的海洋藥用植物，含有豐富的 β–胡蘿卜素、黃酮、甘油、維生素 E、亞麻酸、硒、葉酸、多糖等生理活性物質(zhì)，具有提高人體免疫力、清除自由基、防治癌癥、心血管、老年性癡呆和白內(nèi)障等疾病的功能[2–3]．為了進(jìn)一步提高杜氏鹽藻的藥用價(jià)值，本文以碘酸鉀為誘導(dǎo)劑，研究了其對(duì)杜氏鹽藻抗氧化能力的影響．結(jié)果表明，0.4,g/L的碘酸鉀能明顯提高杜氏鹽藻中β–胡蘿卜素和維生素E的含量(圖 2、圖 3)，4.0,g/L的碘酸鉀明顯提高了杜氏鹽藻中黃酮的含量(圖 1)．表明培養(yǎng)液中的碘酸鉀能提高杜氏鹽藻體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量．體外實(shí)驗(yàn)也表明碘酸鉀增強(qiáng)了杜氏鹽藻提取物清除和·OH的能力(圖 4、圖 5)．

自由基是存在于生物體內(nèi)的一把雙刃劍，在正常濃度范圍內(nèi)，它是機(jī)體的一種功能物質(zhì)，維持著生命活動(dòng)的正常進(jìn)行．但當(dāng)濃度較高時(shí)，則對(duì)機(jī)體有嚴(yán)重的損傷作用，最終導(dǎo)致各種疾病[9]．隨著年齡的增大，人體自身清除活性氧自由基的能力降低，體內(nèi)活性氧的含量逐漸增高．因此，只有借助外來(lái)抗氧化物質(zhì)的幫助，才能維持體內(nèi)自由基的相對(duì)平衡[10]．碘酸鉀提高了杜氏鹽藻體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量，說(shuō)明碘酸鉀能增加杜氏鹽藻的藥用價(jià)值．

中藥材的有效成分常常是一些次生代謝產(chǎn)物，后者是衡量藥材品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)．因此設(shè)法提高次生代謝產(chǎn)物的含量是中藥材研究及生產(chǎn)者追求的目標(biāo)．除基因工程手段外，改變生存環(huán)境也是誘導(dǎo)藥用植物次生代謝產(chǎn)物累積的重要措施[11–12]．碘酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)植物遭受由它引起的氧化脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的一些抗氧化保護(hù)系統(tǒng)被誘導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生較多的抗氧化物質(zhì)來(lái)對(duì)抗這種氧化脅迫．這可能是外源碘酸鉀提高杜氏鹽藻黃酮、β–胡蘿卜素、維生素 E含量的原因所在．

［1］ 張俊杰，郭連城，崔志強(qiáng)，等. 鹽藻工廠化養(yǎng)殖技術(shù)與產(chǎn)品開發(fā)(一)[J]. 鹽業(yè)與化工，2009，38(6)：35-38.

［2］ 索全伶，李淑清，楊偉，等. 內(nèi)蒙古吉蘭泰杜氏鹽藻營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2000，22(4)：345-346.

［3］ 伍先紹，賀稚非，龔霄. 杜氏鹽藻及其在功能食品中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑，2008(2)：127-130.

［4］ 張建華，張忠兵，烏云. 胡蘿卜中 β–胡蘿卜素測(cè)定的方法[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，21(1)：121-124.

［5］ 彧黎 ，凌偉忠，葉勇，等. 可見光及紫外光分光光度法測(cè)定丁香總黃酮含量的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(2)：271-272.

［6］ 劉樹恒. 間接分光光度法測(cè)定藥物中的維生素 E[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27(5)：1890-1892.

［7］ 厐戰(zhàn)軍，周玫，陳瑗. 自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：16，32.

［8］ 徐仰倉(cāng). 羅布麻、綠茶及其配伍對(duì)活性氧清除能力的比較[J]. 中草藥，2007，38(7)：1028-1030.

［9］ Brimfield A A，Soni S D，Trimmer K A，et al. Metabolic activation of sulfur mustard leads to free radical formation[J]. Free Radical Biology and Medicine，2012，52(4)：811-817.

［10］ Takashima M，Horie M，Shichire M，et al. Assessment of antioxidant capacity for scavenging free radicals in vitro：A rational basis and practical application[J]. Free Radical Biology and Medicine，2012，52(7)：1242-1252.

［11］ 徐仰倉(cāng)，李飛飛，徐金. 臭氧對(duì)藥用植物活性物質(zhì)含量的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(12)：2829-2830.

［12］ 徐仰倉(cāng)，徐金，李飛飛，等．H2O2對(duì)藥用植物活性成分含量的影響[J]. 四川中醫(yī)，2011，29(9)：43-45.