海南省和河南省發(fā)生甜瓜褪綠黃化病的分子鑒定

劉珊珊 彭斌等

摘 要：【目的】為了探明引起海南省和河南省甜瓜褪綠黃化的病因，【方法】提取從海南三亞和河南鄭州采集的甜瓜葉片的RNA，用CCYV特異性引物進(jìn)行外殼蛋白基因的克隆、測序，并與GenBank中同屬或同種病毒的cp基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹?！窘Y(jié)果】結(jié)果顯示，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，所得條帶在880 bp左右，與預(yù)期的一致；構(gòu)建cp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，樣品與瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）的親緣關(guān)系很近，屬于同一個分枝，而與該病毒同屬不同種的南瓜黃矮失調(diào)病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV）和大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV） 的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于不同的分枝?！窘Y(jié)論】證實(shí)海南省和河南省甜瓜褪綠黃化病是由瓜類褪綠黃化病毒引起。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 瓜類褪綠黃化病毒； 外殼蛋白基因； 黃化

中圖分類號：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0291-03

瓜類褪綠黃化病是一種近年爆發(fā)的新病害，病原為瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）。該病毒屬于長線病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），通過煙粉虱以半持久性方式傳播，已知在自然界主要侵染葫蘆科作物的甜瓜、西瓜、黃瓜。植物感染CCYV后，通常中下部葉片先感染，逐步向上發(fā)展，新葉常無癥狀。葉片開始出現(xiàn)褪綠， 隨著病情發(fā)展，葉片黃化，同時仍能看見保持綠色的局部組織， 最后全葉黃化，但葉脈仍保持綠色。該病害最早于2004年在日本發(fā)現(xiàn)[1]，我國于2007年，在上海、寧波發(fā)現(xiàn)，目前已分布于廣西、江蘇、山東、浙江[2]和臺灣[3]，此外該病在蘇丹[4]和黎巴嫩也有發(fā)生。關(guān)于該病害在我國的南北分布仍然不清楚，2011年我們實(shí)地調(diào)查海南三亞和河南鄭州的甜瓜病毒病發(fā)生情況，觀察到設(shè)施甜瓜普遍發(fā)生黃化。從發(fā)病的大棚采集病葉，通過病毒外殼蛋白基因（cp）的克隆和序列分析，證實(shí)樣品系CCYV病毒感染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2011年3月在海南三亞樂東縣佛羅鎮(zhèn)長流村、福塘村、鶯歌海、尖峰鎮(zhèn)；2011年10月在河南鄭州河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)園區(qū)采集表現(xiàn)褪綠黃化的甜瓜葉片，編號分別為SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1，保存于-80 ℃。

1.1.2 試劑 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、RNAiso Plus試劑、TaqDNA聚合酶、Ribonuclease Inhibitor和T載體pMD18-T等分子生物學(xué)試劑，產(chǎn)品購自寶生物工程有限公司；75%乙醇（DEPC處理水配制）、氯仿、異戊醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA的提取 參照TaKaRa RNAiso Plus試劑盒的說明，從所采集的甜瓜葉片中提取總RNA。稱取0.2 g樣品于干熱滅菌的研缽中加液氮研磨，加700 μL的RNAiso Plus后勻漿，靜置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，取上清加入140 μL的氯仿振蕩混勻，靜置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清并加入等體積的異丙醇，靜置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。加入1 mL的75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，棄上清保留沉淀，晾干，溶解于30 μL的DEPC處理水中。

1.2.2 cp基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank發(fā)表的CCYV的cp序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物CP-F： CGTAAGTGATCGCAATCAAT，CP-R： AGTGATCACTTGACCATCTCC，擴(kuò)增片段長度876 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以提取的總 RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μL。向經(jīng)過DEPC處理的0.2 mL的離心管中加入3 μL RNA、1 μL CP-R 10 μmol·L-1、3.5 μL dNTPs 25 mmol·L-1、2 μL 5×M-MLV Buffer、0.2 μL的RNA酶抑制劑 40 u·μL-1和0.3 μL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶200 u·μL-1，42 ℃水浴1 h。

PCR反應(yīng)采用15 μL體系，含ddH2O 7.7 μL、10×PCR緩沖液 1.5 μL、dNTPs 2.5 mmol·L-11 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL、10 μmol·L-1的CP-F和CP-R各1 μL、5 u·μL-1 Taq DNA聚合酶 0.3 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性1 min、58 ℃ 退火1 min、72 ℃ 延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸10 min。

1.2.3 目的片段的回收 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照，用大連寶生物工程有限公司的小量DNA片段快速膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆 PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)14～16 h，挑取單菌落，37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)，3～5 h后PCR鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果，轉(zhuǎn)化成功的菌液送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5 序列分析 利用DNAMAN軟件比較所得序列與GeneBank中CCYV的cp基因序列的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR結(jié)果

采用RT-PCR方法對從河南與海南采集的甜瓜葉片進(jìn)行檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，產(chǎn)物大小在880 bp左右，與預(yù)期的一致2.2 核苷酸序列測定與同源性分析

對含有擴(kuò)增片段克隆的大腸桿菌菌液進(jìn)行序列測定，獲得了SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1 5個CCYV分離物的部分基因組序列。擴(kuò)增的片段長876 bp，包含完整的cp基因序列（4941～5693nt；753 bp）和部分cpm基因序列（5693～5740 nt；48 bp）。

用DNAMAN將所得的5個分離物的cp基因的核苷酸序列與GenBank中提交的所有CCYV以及該病毒同屬的南瓜黃矮失調(diào)病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus， CYSDV）和大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus， BYDV ）的cp基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)這5個分離物與CCYV的親緣關(guān)系很近，屬于同一個分枝，而與CYSDV和BYDV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于不同的分枝，因此可以確定該病毒是CCYV。

3 討 論

瓜類褪綠黃化病最早于2004年在日本由Okuda等[1]發(fā)現(xiàn)，直到2010年病原才被發(fā)布，該病由CCYV引起。2007年秋季，在我國寧波、上海、山東發(fā)生甜瓜、西瓜和黃瓜的大面積黃化，通過研究證明這些地區(qū)發(fā)生的瓜類黃化病原是CCYV[2]。世界上目前已知該病害分布于日本、蘇丹、黎巴嫩、中國，在我國分布于廣西、江蘇、山東、浙江和臺灣。由于煙粉虱傳播的病毒病害容易大范圍、大地域的傳播發(fā)生，我們認(rèn)為除上述這些地區(qū)外，可能會有更大范圍的傳播和分布，因此調(diào)查中國最南部的海南省和中部的河南省，發(fā)現(xiàn)秋季種植的甜瓜均發(fā)生大面積黃化，這些黃化的癥狀和病害發(fā)生流行的特點(diǎn)與Gu等[2]報(bào)道過的中國沿海省份地區(qū)如寧波、上海和山東所發(fā)生的瓜類黃化病相同，因此推測是同一種病害。本實(shí)驗(yàn)通過對從海南三亞、河南鄭州采集的樣品進(jìn)行CCYV cp基因克隆和序列分析，證實(shí)CCYV在海南、河南這兩省均有發(fā)生。

瓜類褪綠黃化病毒由煙粉虱以半持久的方式進(jìn)行傳播，僅由成蟲帶毒，該病的發(fā)生與病害發(fā)生地?zé)煼凼陌l(fā)生有著很大的關(guān)系，病害發(fā)生季節(jié)與煙粉虱大發(fā)生時期相一致。B型和Q型煙粉虱傳播該病毒，而Q型煙粉虱傳播的作用可能更大，因此對煙粉虱生物型分布的了解將有助于此病害發(fā)生地的調(diào)查研究。目前還沒有發(fā)現(xiàn)種子攜帶該病毒的情況，而該病害的發(fā)生季節(jié)性非常明顯，主要集中在8—10月份，與大多數(shù)地區(qū)的煙粉虱大爆發(fā)時期一致，同時我們觀察到春季也有發(fā)生，這應(yīng)該取決于瓜類作物種植的環(huán)境，如果是溫室周年種植瓜類作物，那么也會引起春季發(fā)生該病害。

由于該病害是新突發(fā)病害，關(guān)于該病害的研究還非常少，加強(qiáng)該病害流行學(xué)方面的研究無疑有利于我們控制病害。從該病毒在世界及我國的分布來看，該病害已經(jīng)在許多地方分布，所以了解該病毒的遠(yuǎn)距離傳播方式對防止該病害進(jìn)一步蔓延有著重要意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，海南三亞、河南鄭州發(fā)生瓜類褪綠黃化病，說明該病害可能分布于南至海南北至河南的所有地區(qū)。隨著病害的蔓延，極可能會在更大的地域分布。因此監(jiān)測與控制該病害，對于西瓜、甜瓜、黃瓜的產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展是非常重要的。

參考文獻(xiàn) References：

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