原料乳中微生物的多樣性*

劇檸，夏淑鴻

1(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川，750021)2(寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川，750011)

牛乳營養(yǎng)豐富，適合人類食用外，其較高的水分含量和接近中性的pH值也非常適合各種微生物的生長與繁殖［1］。因此，牛乳中存在著復(fù)雜的微生物菌群。這些菌群有的可以使乳及乳制品產(chǎn)生理想風(fēng)味、有的引起乳及乳制品腐敗變質(zhì)，甚至有的還可以使人類產(chǎn)生疾病［2］。傳統(tǒng)方法對原料乳中微生物的研究主要是以純培養(yǎng)為基礎(chǔ)展開的。該方法對菌種的定義取決于對微生物的分離和培養(yǎng)，耗時費力。更重要的是該方法不可避免的忽略了原料乳中占有相當(dāng)大比例的、無法通過培養(yǎng)獲得的微生物菌種。出于該原因，近些年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始越來越多地關(guān)注于應(yīng)用非培養(yǎng)微生物學(xué)的技術(shù)研究原料乳中的微生物，并取得了很大進(jìn)展。

1 原料乳中的微生物

原料乳中含有豐富的微生物，數(shù)量從幾百到幾千個cfu/g不等［3］，隨著冷藏過程的延長，其中的微生物發(fā)生著變化。所有這些微生物可利用原料乳中的蛋白質(zhì)、脂肪和乳糖，維持自身生存的同時對乳質(zhì)產(chǎn)生影響;而其中致病菌的存在則可能引起食品安全問題。原料乳中常見的微生物有3大類，即病原微生物、有害微生物和有益微生物。

1.1 病原微生物

病原微生物是指雖然不改變?nèi)榈男再|(zhì)，但對人體有害的病原菌。牛乳中混入病原菌，貯存不當(dāng)時便會生長代謝產(chǎn)生毒素，在后期加工中雖然病原菌被殺死，但毒素仍有活性，從而使人體中毒。這些病原菌主要有:沙門氏菌、阪崎桿菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、結(jié)核桿菌、布氏桿菌、葡萄球菌以及無乳鏈球菌等［3］。

1.2 有害微生物

有害微生物常稱為腐敗菌，其中最主要的就是嗜冷菌。這類菌可在原料乳低溫貯藏的過程中生長，其產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶經(jīng)高溫滅菌后仍有活性，可分解乳中的蛋白質(zhì)和脂肪，對工業(yè)生產(chǎn)帶來極大不便。這類菌主要包括假單胞菌屬、黃桿菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬。Dina Raats等［4］采用DGGE技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其中占主要比例的菌群均為假單胞菌屬。由于嗜冷菌對產(chǎn)品造成的危害較大，近年來國內(nèi)外對其研究較為詳細(xì)，對其檢測及鑒定的研究在本文2.2處將有詳細(xì)論述。

1.3 有益微生物

原料乳中有益微生物主要是乳酸菌，而乳酸菌主要包括鏈球菌屬、明串珠菌屬和乳桿菌屬。它們被分離出來廣泛地應(yīng)用于乳制品的生產(chǎn)中。屬于鏈球菌屬的乳酸鏈球菌幾乎在所有生鮮乳中都能檢出，它是原料乳酸度升高的主要原因。該菌可以產(chǎn)生乳酸鏈球菌素(NISIN)，抑制其他細(xì)菌的繁殖。明串珠菌由于其可以分解檸檬酸生成香味物質(zhì)丁二酮，在生產(chǎn)中應(yīng)用其產(chǎn)生獨特的風(fēng)味。乳桿菌屬中最具代表的是保加利亞乳桿菌，它可以和鏈球菌屬中的嗜熱鏈球菌共同作用生產(chǎn)酸乳。此外，屬于乳桿菌屬的嗜酸乳桿菌被認(rèn)為是通過篩選，可以有效調(diào)節(jié)腸道的良好益生菌;干酪乳桿菌是用于生產(chǎn)干酪的主要菌種。

1.4 其他微生物

除上述細(xì)菌外，原料乳中還存在著其他龐大的微生物群。例如、大腸菌群、丙酸菌、丁酸菌、微球菌等。除細(xì)菌外，原料乳中還含有酵母、霉菌、放線菌以及噬菌體等微生物。

2 國內(nèi)研究進(jìn)展

我國關(guān)于原料乳中微生物的研究主要集中在微生物污染狀況，腐敗菌的鑒定以及致病菌的快速檢測方面;對原料乳從擠入直至加工前整個階段的菌群結(jié)構(gòu)及變化報道較少。

2.1 關(guān)于原料乳中細(xì)菌總數(shù)監(jiān)測的研究

原料乳的污染狀況主要以細(xì)菌的菌落總數(shù)為主要指標(biāo)。目前國內(nèi)還主要采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法，通過菌落總數(shù)這一指標(biāo)，對原料乳微生物的污染情況、污染來源以及隨季節(jié)和溫度的變化進(jìn)行研究。何開兵［5］對新疆石河子生鮮牛乳微生物狀況進(jìn)行檢驗，發(fā)現(xiàn)牛場微生物污染嚴(yán)重，甚至有超標(biāo)現(xiàn)象。黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所［6］對2011年黑龍江省生鮮乳中菌落總數(shù)監(jiān)測情況顯示，乳頭樣品的菌落總數(shù)＜冷藏儲奶罐中樣品的菌落總數(shù)＜運輸車樣品的菌落總數(shù)。李博等［7］對不同季節(jié)原料乳中主要微生物和理化指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與春夏相比，冬季牛乳的營養(yǎng)成分較高、細(xì)菌總數(shù)較低。崔海輝［8］通過測定菌落總數(shù)的方法研究了原料乳質(zhì)量和貯存溫度及貯存時間之間的關(guān)系，結(jié)果表明在4℃貯存條件下，原料乳存放36 h，對質(zhì)量沒有較大的影響;在原料乳溫度達(dá)到10～15℃的時候，存放時間不宜超過12 h。

在采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的同時，國內(nèi)的工作者也積極探討其他方法監(jiān)測細(xì)菌總數(shù)，包括早先的基于計算機(jī)技術(shù)的給予支持向量機(jī)的分類技術(shù)［9］、基于電導(dǎo)率微生物檢測技術(shù)［10－11］等都或多或少的存在各自的局限。田麗萍［12］等通過使用ATP生物發(fā)光技術(shù)與FOSS細(xì)菌總數(shù)測定儀檢測原料乳中細(xì)菌總數(shù)的比較實驗，確定了ATP生物發(fā)光技術(shù)與FOSS細(xì)菌總數(shù)測定儀的檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，且成本低廉，是一種值得推廣的新型技術(shù)。

2.2 關(guān)于腐敗菌的研究

嗜冷菌污染是現(xiàn)代乳制品加工過程中最常見的問題［13］。該菌在原料乳的冷藏過程中大量繁殖，逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌，經(jīng)過加熱雖然可以被殺死，但它其中的某些菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶和脂肪酶能夠分解蛋白質(zhì)、脂肪，從而導(dǎo)致乳制品品質(zhì)發(fā)生變化，如出現(xiàn)苦味、腐敗味或形成膠凝。嗜冷菌幾乎覆蓋了乳中常見細(xì)菌的所有類群，較為常見的有:假單胞桿菌、產(chǎn)堿桿菌、產(chǎn)氣桿菌、沙雷氏菌、克雷伯氏桿菌。任靜［14］選用Sherlock全自動微生物鑒定系統(tǒng)，從40份原料乳樣品中分離篩選得到30株嗜冷菌。同時，研究指出原料乳中占優(yōu)勢的嗜冷菌，為腐臭假單胞菌、小球諾卡氏菌、糞鞘脂桿菌和惡臭假單胞菌。呂元［15］以杭州地區(qū)牧場的原料奶為對象，對其中的嗜冷菌進(jìn)行分離鑒定，確定其中的優(yōu)勢嗜冷菌種為熒光假單胞菌、魯氏不動桿菌和阪崎腸桿菌。除傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對嗜冷菌進(jìn)行分離鑒定外，近些年，研究者也找尋著其他一些方法來對嗜冷菌進(jìn)行鑒定。關(guān)晶巖等［16］根據(jù)嗜冷菌中占優(yōu)勢的假單胞菌屬，選擇特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;建立了一種原料乳中快速PCR計數(shù)嗜冷菌的新方法。該方法與國際標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)法比較無明顯差異，卻可以大大縮短計數(shù)時間。呂元［17］研究發(fā)現(xiàn)嗜冷菌數(shù)量和對硝基苯胺濃度之間有著很好的線性關(guān)系，建立的胺肽酶法檢測嗜冷菌的技術(shù)，適用檢測自然條件下腐敗的原料奶中嗜冷菌的數(shù)量。此外，岳喜慶［18］采用Azocasein法和堿式滴定法對嗜冷菌產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的活力進(jìn)行了測定。研究了嗜冷菌在原料乳中的生長規(guī)律。說明了原料乳在低溫貯藏過程中，嗜冷菌數(shù)與蛋白質(zhì)、脂肪、水分、密度、pH值也存在有數(shù)學(xué)相關(guān)性?？梢?，國內(nèi)對嗜冷菌的研究涵蓋了菌種的分離鑒定、生長特性及產(chǎn)酶特性、快速檢測以及對乳制品品質(zhì)的影響等多方面的研究。

2.3 有關(guān)致病菌的監(jiān)測

牛乳易感染金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等具有致病性的微生物。國內(nèi)近些年對這些致病菌的研究主要側(cè)重于菌種的快速檢測、溯源、風(fēng)險評估以及產(chǎn)毒情況的研究。目前使用的檢測方法大多采用分子方法對特定致病菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，該檢測方法具有快速、簡單、靈敏度高的特點。劉繼超［19］等通過多重PCR的方法，建立了一種快速檢測沙門氏菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的方法，該方法具有簡單、快速、靈敏度高的特點。周微［20］等利用熒光定量PCR技術(shù)建立起一種快速檢測原料乳中大腸桿菌數(shù)量的方法。姜毓君［21］等利用過濾富集菌體后的PCR技術(shù)來檢測原料乳中大腸桿菌O157:H7，在傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上做了有效改進(jìn)，使得原料乳中的大腸桿菌O157:H7的檢測能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏地進(jìn)行。閆軍［22］等采用PFGE對個體養(yǎng)殖戶、奶站和奶牛場的2批樣品(土壤、牛糞、裝奶空桶、牛體后臀、乳房、頭3把奶、桶中奶和人手)的金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行溯源分析，結(jié)果表明，頭3把奶的污染會不同程度地由牛后臀和牛糞引起，而桶中奶則被人手、空桶和土壤污染。雖然溯源結(jié)果表明原料乳的污染是外源性原因引起的，但是不能排除乳房炎造成的交叉污染。

產(chǎn)孢菌是另一類存在于乳中的可以導(dǎo)致腐敗和致病的菌群。這類種群包括芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及枯草桿菌等。其中蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的致吐腸毒素可導(dǎo)致嘔吐腹瀉癥狀，容易與乳糖不耐癥混淆，而被忽視。因此，吳海清［23］對原料乳中的蠟樣芽孢桿菌的污染情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明蠟樣芽孢桿菌數(shù)與原料乳的微生物污染狀況無相關(guān)性。趙寧［24］對蠟樣芽孢桿菌采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，整個過程只需6h，是對傳統(tǒng)方法的有效改進(jìn)。

對于致病菌的風(fēng)險評估，遇曉杰等采用對奶牛場及奶戶進(jìn)行抽樣調(diào)查，確定原料乳中的特征性致病菌并采取預(yù)測微生物學(xué)的方法，建立了原料乳中該致病菌的最適生長模型。同時，結(jié)合流行病學(xué)資料以及對該地區(qū)原料乳收購過程的調(diào)查，最終建立原料乳中金黃色葡萄球菌的防控措施。

3 國外研究進(jìn)展

國外的研究者很早就開始關(guān)注原料乳質(zhì)量問題，對影響原料乳質(zhì)量的菌群的研究方法也從傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方式轉(zhuǎn)變成采用分子生物學(xué)手段［25－26］，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確及時。近些年來，研究者對原料乳直至加工前的微生物監(jiān)測延伸到各個方面，并且取得了一些有用的信息，為工業(yè)化生產(chǎn)乳制品(特別是奶酪)提供了有利的保障。國外研究主要從以下幾方面入手:

3.1 環(huán)境與原料乳中微生物菌群的關(guān)系

Martina Fricker等［27］采用純培養(yǎng)和分子方法相結(jié)合，使用FTIR和16S rDNA測序的方法對來自于歐洲3個國家農(nóng)場和工廠奶罐中的微生物進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)工廠和農(nóng)場奶罐中的微生物菌群結(jié)構(gòu)明顯不同，但各地理環(huán)境之間無明顯差異。Bonizzi［28］等對來自于意大利西北地區(qū)高山、峽谷和低洼地帶的牛乳，采用ITS分析其中的微生物，發(fā)現(xiàn)3個不同環(huán)境中的微生物構(gòu)成不同。Hagi等［29］對不同飼喂方式下原料乳的微生物群系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)戶外與室內(nèi)飼養(yǎng)時的優(yōu)勢菌群均為乳桿菌，但在戶外飼養(yǎng)8 d后出現(xiàn)了葡萄球菌。Dina Raats［30］等采用 DGGE和克隆文庫的方法對原料乳及其冷藏過程中菌群的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)原乳中主要是桿菌屬、梭菌屬和放線菌屬的G+菌，而冷藏后主要菌群轉(zhuǎn)變?yōu)榈腉－菌。研究還發(fā)現(xiàn)對乳腐敗起作用的放線菌在農(nóng)場乳樣中占一定比例，在評估最初原料乳質(zhì)量時應(yīng)得到重視。此外，原料乳中存在的酵母菌群也不容被忽視，他們對乳制品風(fēng)味的影響不容忽視［31］。以上研究說明，原料乳中的菌群結(jié)構(gòu)受所處地理環(huán)境、飼喂方式的影響，并隨冷藏時間以及冷藏溫度的不同而發(fā)生變化。

3.2 用于原料乳微生物多樣性研究的分子生物學(xué)方法的建立

由于分子生物學(xué)技術(shù)可以做到對多數(shù)無法培養(yǎng)的微生物的監(jiān)測，采用分子生物學(xué)的手段研究微生物的多樣性是近些年的一個熱點。因此，選用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)方法以及對該方法的改進(jìn)是能否全面準(zhǔn)確地對原料乳中的微生物進(jìn)行描述的關(guān)鍵。

3.2.1 DNA的提取

采用分子生物學(xué)的方法研究類似原料乳這種含有復(fù)雜菌群的樣品，關(guān)鍵在于從樣品中所提取的DNA濃度和純度。高純度和濃度的DNA對后續(xù)試驗的精確度起著重要作用。

碳水化合物，蛋白質(zhì)和鹽類的存在會妨礙核酸提取。通過機(jī)械(離心、冷凍、鋯珠破碎等)、酶裂解細(xì)胞、蛋白質(zhì)消化和DNA沉淀都可以提高DNA的提取能力。Duthoit［32］比較了4種方法提取的DNA的效果，結(jié)果表明采用苯酚提取的方法效果最好。此外，目前在許多研究中，實驗者直接采用核酸提取試劑盒來提取DNA，從而獲得高純度的DNA。

3.2.2 目的基因的選擇

基因組DNA提取后，就需要選擇目的基因片段進(jìn)行研究。目前用來分析菌種歸屬的主要目的基因為16S rDNA片段或16S～23S rDNA間區(qū)。其中對16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增最為常見，其次才是對V4區(qū)的擴(kuò)增。此外，研究者也選用其他目的基因，看家基因序列分析技術(shù)就是其中之一?？醇一騪heS和rpoB就常被用來分析菌群多樣性。Lafarge等［33］使用rpoB引物對來自乳中的菌種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)DGGE凝膠電泳后每個菌種都有一條單一的條帶，與16S rDNA的V3區(qū)的電泳圖譜比較后證明rpoB可以替代16S rDNA的V3區(qū)用來定義乳及乳制品中的腐敗和致病菌。

3.2.3 分子標(biāo)記技術(shù)的選擇

如今，國際上已廣泛使用分子標(biāo)記技術(shù)對菌種進(jìn)行鑒定。研究者可以通過16S rDNA測序后在基因庫中與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比較確定菌種歸屬。也可以通過焦磷酸測序、DGGE/TGGE、T-RFLP、SSCP、FISH、qPCR等技術(shù)研究原料乳中微生物多樣性。以上分子標(biāo)記技術(shù)都有其自身的優(yōu)缺點。這些技術(shù)可與無需培養(yǎng)或純培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，針對需要解決的特定問題，選擇正確的分子標(biāo)記技術(shù)，可達(dá)到事半功倍的效果。例如，qPCR技術(shù)可用來對微生物進(jìn)行定量，但對復(fù)雜樣品中微生物的多樣性的確定十分有限，且使用該技術(shù)檢出率低，重復(fù)性較差。DGGE技術(shù)是近年來用于分析類似原料乳這種復(fù)雜樣品中微生物多樣性的常用方法。該方法的優(yōu)點是樣品中的微生物無需經(jīng)過純培養(yǎng)即可得到分析，更大程度上使無法培養(yǎng)的微生物檢出，彌補了純培養(yǎng)復(fù)雜費時的缺點。此外，DGGE和T-RFLP還可以用來半定量樣品中的微生物。但是，通常DGGE技術(shù)需要使用具有高GC含量的引物以防止DNA在電泳過程中完全解鏈，這就會導(dǎo)致PCR退火過程中產(chǎn)生人為誤差，如果16S片段高度相似的話，會導(dǎo)致樣品多樣性被誤判［34］。焦磷酸測序技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)。使用該方法無需對樣品進(jìn)行克隆，可以同時進(jìn)行超過30 000個序列的分析技術(shù)，與第一代測序技術(shù)相比，在分析微生物群落結(jié)構(gòu)上具有更為快速、高效的特點。該技術(shù)已被用于研究海產(chǎn)品［35］、蔬菜［36］、米糠［37］及干酪［38］等食品中的微生物群落，取得了較好的效果。迄今為止，這種方法還沒有大規(guī)模地應(yīng)用于原料乳中微生物的監(jiān)測，隨著科技的發(fā)展，該技術(shù)的應(yīng)用將更加普遍。

3.2.4 純培養(yǎng)方法與非培養(yǎng)方法的比較

基于分子生物學(xué)方法的非培養(yǎng)技術(shù)在對很多難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物的研究方面有著其獨特的優(yōu)勢［39］。使用非培養(yǎng)的方法，原料乳中以前沒有檢出過的微生物得以發(fā)現(xiàn)，對研究原料乳變化以及乳制品生產(chǎn)起著積極作用。Callon等［40］采用SSCP和RFLP技術(shù)對山羊乳進(jìn)行整個泌乳周期的跟蹤，發(fā)現(xiàn)乳中存在一些與干酪生產(chǎn)相關(guān)的非典型菌種，如棒狀乳桿菌和短乳桿菌以及一些非典型嗜鹽微生物，該研究對干酪風(fēng)味隨原料奶質(zhì)量的季節(jié)變化的研究具有積極作用。此外，非培養(yǎng)技術(shù)對原料乳中致病菌的快速檢測也起著積極作用。例如，Slana等［41］對345份乳樣的檢測中，使用純培養(yǎng)的方式監(jiān)測8個月未檢出MAP，而采用qPCR技術(shù)其中有111個樣品呈陽性，qPCR技術(shù)的檢測水平可以達(dá)到10個細(xì)胞/mL牛乳。

值得注意的是，純培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法檢測乳及乳制品中的微生物，它們之間存在著一定的偏差，例如表1中所示，有時采用同樣的樣本，純培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的微生物多樣性更加豐富。這就要求研究者在今后的多樣性研究中增加非培養(yǎng)技術(shù)的可靠性，從而更好地發(fā)揮非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢。

表1 應(yīng)用純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)對乳制品中的微生物的研究比較Table 1 Comparison of studies employing both culture-dependent and culture-independent techniques for the analysis of microbial communities of milk products

4 總結(jié)與展望

由于PCR技術(shù)的發(fā)明，微生物生態(tài)領(lǐng)域在速度和分子方法上發(fā)生了深刻變革，使我們對不同環(huán)境下微生物菌群的結(jié)構(gòu)及菌群動力學(xué)具有了深刻的了解。本綜述介紹了國內(nèi)外近年來關(guān)于原料乳中微生物多樣性的研究進(jìn)展。并對非培養(yǎng)微生物學(xué)在研究原料乳中微生物多樣性的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，高度評價了非培養(yǎng)方式的快速、敏感以及可定義純培養(yǎng)方式無法發(fā)現(xiàn)的微生物的特點。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的改進(jìn)以及下一代測序技術(shù)的深入研究，人類在食品微生物領(lǐng)域的研究將更加深入，這其中就包括在原料乳及乳制品中的微生物多樣性方面的研究。

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