規(guī)?；苽湓逅{(lán)蛋白工藝技術(shù)研究進(jìn)展*

邵明飛，趙楠，劉冰，秦松

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210095)2(曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東曲阜，273165)3(中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所生物資源實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺，264003)

藻藍(lán)蛋白作為天線捕光色素蛋白，是由一個(gè)輔基蛋白與藻藍(lán)膽素(開鏈線性四吡咯)共價(jià)結(jié)合而成，其基本構(gòu)架是由α亞基與β亞基形成單聚體(αβ)，然后單聚體間通過連接多肽形成三聚體(αβ)3或者六聚體(αβ)6。α亞基84位處的半胱氨酸與β亞基84位處、155位處的半胱氨酸各通過硫醚鍵共價(jià)連接藻藍(lán)膽素［1－2］。

藻藍(lán)蛋白是一種天然藍(lán)色色素，已作為食物色素添加在軟飲料，口香糖，唇膏，眼線等產(chǎn)品中。高純度的藻藍(lán)蛋白因其具有高效的熒光性，被作為生物化學(xué)探針應(yīng)用在免疫分析研究［3－4］。藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保肝護(hù)肝、抗癌、抗炎等諸多生理活性，具有重大的潛在藥用開發(fā)價(jià)值［1，5－9］。藻藍(lán)蛋白主要從螺旋藻、魚腥藻等藻類中提取純化得來，不同純度(A620/A280)的藻藍(lán)蛋白有不同的用途。A620/A280大于等于0.7時(shí)，藻藍(lán)蛋白為食品級;A620/A280大于等于3.9時(shí)，藻藍(lán)蛋白為反應(yīng)級;A620/A280大于等于4.0時(shí)，藻藍(lán)蛋白為分析級［10］。藻藍(lán)蛋白具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但繁瑣的純化步驟不僅制約著它的大規(guī)模生產(chǎn)也導(dǎo)致其價(jià)格昂貴。食品級藻藍(lán)蛋白的價(jià)格約為0.13美元/mg，分析級的藻藍(lán)蛋白價(jià)格為1 ～5 美元/mg［11］。

藻藍(lán)蛋白純化過程的費(fèi)用約占其成本的50%～90%［12］。藻藍(lán)蛋白傳統(tǒng)純化方法包括:(1)破碎細(xì)胞，制備藻藍(lán)蛋白粗提液;(2)應(yīng)用傳統(tǒng)的分離技術(shù)純化藻藍(lán)蛋白，如離心、硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析等。這些方法耗時(shí)、復(fù)雜，難以大規(guī)模制備藻藍(lán)蛋白［13］。近幾年新技術(shù)如雙水相萃取技術(shù)、反膠團(tuán)萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)、擴(kuò)張床吸附層析等的不斷發(fā)展給藻藍(lán)蛋白規(guī)?；苽涔に嚨奶嵘峁┝诵聶C(jī)遇。本文對這些新技術(shù)在藻藍(lán)蛋白規(guī)?；苽渖系膽?yīng)用研究進(jìn)行了綜述。

1 雙水相萃取技術(shù)

大部分萃取采用的一個(gè)是水相，另一個(gè)是有機(jī)相。但有機(jī)相溶液易使蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)變性。一些高分子水溶液(如分子質(zhì)量從幾千到幾萬的聚乙二醇與磷酸鹽組合成的水溶液)可以分為2個(gè)水相，生物質(zhì)在2個(gè)水相中的溶解度有很大的差別，進(jìn)而選擇性分配［14］，故可以利用雙水相體系萃取分離蛋白質(zhì)等水溶性的生物產(chǎn)品。很多實(shí)例報(bào)道表明雙水相體系已成功應(yīng)用于大規(guī)模處理富集分離生物物質(zhì)［15］。

Patil等［12，16］設(shè)計(jì)了一個(gè)簡單而高效的技術(shù)流程，該流程包括2個(gè)步驟:雙水相萃取和離子交換吸附層析，其研究結(jié)果:從螺旋藻中得到的藻藍(lán)蛋白粗提物，其純度為1.18，經(jīng)過雙水相萃取后，純度提高為5.22，繼續(xù)經(jīng)離子交換吸附層析柱純化 ，純度從5.22上升為6.69。操作流程具體如下:(1)用蒸餾水清洗新鮮螺旋藻2～3次，洗滌干凈的螺旋藻經(jīng)壓力為200～400 kg/cm2的高壓細(xì)胞勻漿機(jī)破碎5～6 min。將破碎的螺旋藻懸濁液于離心機(jī)中離心 10 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，得到的藻藍(lán)蛋白粗提液于4～5℃下儲存;(2)向藻藍(lán)蛋白粗提液中加入總體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.28%的聚乙二醇和11.63%的磷酸鉀鹽，徹底攪拌1h，靜置過夜使兩相分開，分別移取上下相的溶液，在波長280，620，650 nm處測上下相溶液的吸光度，計(jì)算各相藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度和純度;(3)經(jīng)上述步驟富集分離得到的藻藍(lán)蛋白液過DEAE-Sephadex陰離子交換層析柱，采用0～0.35 mol/L的NaCl進(jìn)行線性洗脫，收集NaCl濃度為0.25～0.3 mol/L時(shí)的洗脫液，透析凍干成粉。劉楊等［17］以PEG/硫酸鈉雙水相體系，從鈍頂螺旋藻細(xì)胞破碎液中富集分離藻藍(lán)蛋白。其研究結(jié)果表明，萃取最適條件為 1%KCl，15%Na2SO4，12%PEG4000，分離因素達(dá)到6.33，分配系數(shù)達(dá)到8.01，藻藍(lán)蛋白回收率為91.2%。

雙水相萃取技術(shù)在富集分離生物活性物質(zhì)上具有以下優(yōu)勢:(1)兩相含水量均高達(dá)70% ～90%，適于提取水溶性的蛋白質(zhì)、酶等生物活性物質(zhì)，且不易引起蛋白質(zhì)的變性失活;(2)不存在有機(jī)溶劑殘留問題;(3)易于放大和連續(xù)操作，各種參數(shù)可按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低［18］。

2 反膠團(tuán)萃取技術(shù)

反膠團(tuán)是指非極性溶劑中表面活性劑分子濃度超過臨界膠束濃度引發(fā)形成的表面活性劑的極性頭朝內(nèi)、非極性頭朝外的具有極性內(nèi)核的多分子聚集體［19］。反膠團(tuán)的極性內(nèi)核可溶解少量水而形成微型水池，可溶解蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等生物物質(zhì)。微型水池周圍包裹的一層水膜以及表面活性劑極性頭的保護(hù)可避免生物物質(zhì)與有機(jī)溶劑直接接觸而失活。通過調(diào)節(jié)水相pH值及鹽離子濃度等因素使生物物質(zhì)反萃取到水相中，實(shí)現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離［20］。

劉楊等［21］采用 CTAB/正戊醇-正辛烷反膠團(tuán)溶液萃取分離藻藍(lán)蛋白，并研究了有機(jī)相中助劑濃度、表面活性劑濃度與水相中離子種類、強(qiáng)度等因素對萃取效果的影響。研究結(jié)果表明，采用0.04 mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷(體積比1∶4)的反膠團(tuán)溶液萃取pH 7.0的螺旋藻細(xì)胞破碎液(包含0.1 mol/L KCl)，分配系數(shù)達(dá)26.0，藻藍(lán)蛋白萃取率達(dá)96.3%;采用pH 5.0的反萃取液(包含2 mol/L KBr)反萃取藻藍(lán)蛋白，反萃取率達(dá)90.6%。具體操作步驟:(1)稱取0.5 g螺旋藻粉，加入100 mL pH 7.0 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻后反復(fù)凍融3次。將破碎的螺旋藻細(xì)胞懸濁液經(jīng)離心機(jī)離心20 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，獲得藻藍(lán)蛋白粗提液;(2)將CTAB以體積比為1∶4的比例溶于正辛烷和正戊醇的混合液中，并用磷酸鹽緩沖液洗滌2～3次 ，得到透明澄清的CTAB反膠團(tuán)溶液;(3)反膠團(tuán)溶液和藻藍(lán)蛋白粗提液等體積加入到10 mL具塞離心管 ，以60次/min的頻率，恒溫25℃上下顛倒離心管10 min，靜置分層，移取水相;(4)向離心管中加入與上相等體積的pH 7.0 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.1 mol/L KCl)溶液 ，恒溫25℃，以60次/min的頻率上下顛倒離心管2 h，靜置分層，移取水相，水相即為反膠團(tuán)反萃取液。

反膠團(tuán)萃取技術(shù)在富集分離生物活性物質(zhì)上具有以下優(yōu)勢:(1)選擇性好、分離效率高;(2)分離速度快，具有提純和濃縮作用;(3)分離條件溫和，保持生物物質(zhì)高活性;(4)正萃和反萃同時(shí)進(jìn)行，分離料液處理簡單，易放大，操作方便。

3 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)被認(rèn)為是對傳統(tǒng)化學(xué)分離方法的一次革命，其利用天然或人工合成的、具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力，實(shí)現(xiàn)對雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑選擇性分離的技術(shù)［22］。純化分離所采用的膜主要是超/微濾膜，由于其所能截留的物質(zhì)粒徑大小分布范圍廣，被廣泛應(yīng)用于固液分離、大小分子物質(zhì)的分離、脫除色素、產(chǎn)品提純、油水分離等工藝過程中。

Jaouen等［23］用膜分離技術(shù)對螺旋藻的藻藍(lán)蛋白提取液進(jìn)行純化和濃縮。具體操作流程為:(1)Zarrouk培養(yǎng)基培養(yǎng)的螺旋藻收獲后用滅過菌的去離子水清洗，藻體懸濁液在－35℃進(jìn)行凍融，最后用超聲波處理;(2)采用有機(jī)管膜的納濾膜MT03，其截通分子質(zhì)量為500Da，膜面積為0.05 m2/module，控制進(jìn)料壓力為30×105Pa，切線流速為1.5 m/s，對上述樣品進(jìn)行處理，得到藻藍(lán)蛋白的回收率為100%，濃縮因子達(dá)到7。Chaiklahan等［24］采用超微濾膜的方法處理藻藍(lán)蛋白粗提液，得到了食品級藻藍(lán)蛋白，其操作流程為:(1)新鮮的螺旋藻按照1∶100的比例加入磷酸鹽緩沖液，用漿輪不斷攪拌4h，轉(zhuǎn)速為300 r/min;(2)懸濁液離心15 min，離心力為4 800×g，去除細(xì)胞碎片，得到藻藍(lán)蛋白粗提液;(3)采用膜孔徑為5um的濾膜，按照流速為150 mL/min，滲透通量為58.5L/(h·m2)的處理?xiàng)l件對藻藍(lán)蛋白粗提液進(jìn)行粗過濾，藻藍(lán)蛋白的回收率為88.6%;以膜孔徑為0.8/0.2um的濾膜，采用流速為100 mL/min，滲透通量為336L/(h·m2)的處理?xiàng)l件對粗過濾得到的濾液進(jìn)行精過濾，藻藍(lán)蛋白的回收率為82.9%;(4)采用截通分子質(zhì)量為50 kDa，平均滲透量為26.8L/(h·m2)的濾膜，按照壓強(qiáng)為69kPa，流速為75 mL/min的處理?xiàng)l件對精過濾得到的濾液進(jìn)行超濾。經(jīng)過這幾步處理，藻藍(lán)蛋白的純度達(dá)到1.0左右，即達(dá)到食品級要求。

超/微濾膜過濾與傳統(tǒng)過濾的不同在于不同分子質(zhì)量的化合物可通過膜進(jìn)行有效分離，這個(gè)過程是一種物理過程，不發(fā)生相的變化，不需要添加助劑。采用膜進(jìn)行分離純化的優(yōu)點(diǎn)［25－26］:(1)分離效果好，過濾分離回收率高，產(chǎn)品質(zhì)量高，運(yùn)行成本低;(2)過程無需添加化學(xué)藥品、溶媒溶劑，不帶入二次污染物質(zhì);(3)設(shè)備可自動運(yùn)行，穩(wěn)定性好，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化擴(kuò)產(chǎn)需求。

4 擴(kuò)張床吸附技術(shù)

擴(kuò)張床吸附(expanded bed absorption，EBA)技術(shù)是20世紀(jì)90年代開發(fā)的一種新型生化分離技術(shù)［27］，最大特點(diǎn)是可以從含有固體生物質(zhì)顆粒(如細(xì)胞、細(xì)胞碎片)的料液中直接捕獲目標(biāo)物，集固液分離、濃縮和初期純化于一個(gè)單元操作之中，可以縮短分離步驟，減少活性物質(zhì)損失，提高產(chǎn)品收率，節(jié)省分離成本，而且獲得的高濃度、高純度的粗提液可直接用于下一步的純化操作，體現(xiàn)了生物分離過程的集成化優(yōu)勢［28］。

Ramos等［29］采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)大規(guī)模純化水生集胞藻藻藍(lán)蛋白，技術(shù)流程如下:通過滲透沖擊法(pH 7.0、50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，浸提3次)破碎水生集胞藻細(xì)胞壁，離心獲得上清液(A615/A280為0.7)，流經(jīng) EBAC(吸附劑為 Streamline-DEAE，柱內(nèi)徑15 mm;最優(yōu)參數(shù)為:吸附量4.9 mg/mL吸附劑，擴(kuò)張床體積為固定床的2倍，進(jìn)樣液黏度1.020 mPa，pH 7.0、500 mmol/L 磷酸鈉緩沖液洗脫)，此步驟藻藍(lán)蛋白回收率為91%;富含藻藍(lán)蛋白的洗脫液(A615/A280為2.61)經(jīng)透析后再經(jīng)DEAE陰離子交換層析柱純化(吸附劑為DE-52，柱2.5 cm×20 cm，pH 7.0、290 mmol/L磷酸鈉緩沖液洗脫，流速50 mL/h)進(jìn)行純化，此純化步驟藻藍(lán)蛋白回收率為76%，A615/A280大于4.0;最終藻藍(lán)蛋白回收率為69%，向富含藻藍(lán)蛋白的洗脫液添加硫酸銨至飽和度為70%，4℃靜置12 h，離心，沉淀復(fù)溶于5 mmol/L磷酸鈉緩沖液中，4℃透析過夜，真空冷凍干燥成粉。Bermejo R等［30］采用1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)浸泡螺旋藻，然后離心獲得藻藍(lán)蛋白粗提液，經(jīng)透析后進(jìn)而經(jīng)裝填有陰離子交換樹脂Streamline-DEAE的擴(kuò)張床吸附柱純化，洗脫收集藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)大于2.0的洗脫液，回收率為80%;收集到的富含藻藍(lán)蛋白洗脫液透析后再經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析色譜純化，收集藻藍(lán)蛋白洗脫液;向藻藍(lán)蛋白洗脫液中添加硫酸銨至飽和度為70%，離心后收集沉淀，沉淀復(fù)溶后透析，經(jīng)DEAE-52離子交換層析柱純化，藻藍(lán)蛋白洗脫液經(jīng)透析后，冷凍干燥成粉，最終藻藍(lán)蛋白的得率為9.6%。Niu等［13］采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)從劣質(zhì)的螺旋藻粉中制備藻藍(lán)蛋白，其工藝流程為:采用0.5mol/L濃度的硫酸銨浸泡螺旋藻粉，經(jīng)離心獲得藻藍(lán)蛋白粗提液;藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)填充Phenyl-sepharose柱料的擴(kuò)張床色譜純化后，洗脫液中藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)達(dá)2.87;純度(A620/A280)為2.87的藻藍(lán)蛋白溶液透析后再經(jīng)Q-sepharose離子交換層析柱純化，收集藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)大于3.2的洗脫液，其余部分洗脫液透析后經(jīng)羥基磷灰石柱層析純化，收集純度(A620/A280)大于3.2的藻藍(lán)蛋白洗脫液;最終匯總純度(A620/A280)大于3.2的藻藍(lán)蛋白溶液，經(jīng)透析后冷凍干燥成干粉，回收率為13.7%。Ramos等［31］利用擴(kuò)張床吸附色譜技術(shù)提取魚腥藻凍干粉中的藻藍(lán)蛋白，其流程為:按照1∶20的料液比獲得藻粉懸浮體系，常溫磁力攪拌，離心，獲得藻藍(lán)蛋白粗提液;藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)Streamline-DEAE擴(kuò)張床吸附色譜柱純化后，收集富含藻藍(lán)蛋白的洗脫液;藻藍(lán)蛋白洗脫液經(jīng)硫酸銨沉淀、復(fù)溶、透析，再經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析色譜柱純化，收集富含藻藍(lán)蛋白洗脫液;向藻藍(lán)蛋白洗脫液中添加硫酸銨至飽和度為70%，4℃黑暗條件靜置過夜，離心，沉淀復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液，再經(jīng)透析得到藻藍(lán)蛋白溶液，最終藻藍(lán)蛋白回收率為62%，溶液冷凍干燥為藻藍(lán)蛋白粉。

5 展望

藻藍(lán)蛋白作為熒光探針可用于細(xì)胞及大分子標(biāo)記，作為天然色素可用于食品及化妝品行業(yè)，其具有抗氧化、抗癌活性，可作為治療藥物用于醫(yī)藥領(lǐng)域。雖然藻藍(lán)蛋白有諸多用途，但高昂的純化制備費(fèi)用限制了藻藍(lán)蛋白的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的藻藍(lán)蛋白純化流程包括很多單元操作，如沉淀、離心、透析、離子交換色譜層析、凝膠過濾色譜層析、羥基磷灰石色譜層析等。一般來說，傳統(tǒng)的藻藍(lán)蛋白制備方法主要包括2個(gè)過程:(1)樣品的預(yù)處理，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，獲得粗提液;(2)應(yīng)用傳統(tǒng)色譜技術(shù)純化藻藍(lán)蛋白。樣品前處理主要目的是破碎細(xì)胞，方法有超聲波破碎、酶解、凍融、機(jī)械破碎、利凡諾處理、吐溫X-100處理、丙酮處理等。其中，凍融、滲透沖擊、超聲波破碎是實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞破壁方法。高壓細(xì)胞破碎技術(shù)及珠磨破碎技術(shù)破壁效率高，在工業(yè)上應(yīng)用較多。細(xì)胞破壁后，經(jīng)固液分離獲得粗提液。第二步涉及到多種色譜層析的綜合利用，包括疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析。這些傳統(tǒng)方法的一大弊端在于步驟繁瑣，目的產(chǎn)物損失較大，成本較高，耗時(shí)長，很難規(guī)?；僮?。提高細(xì)胞破壁效果，減少純化步驟，提高產(chǎn)品的純度和收率是藻藍(lán)蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵。本文綜述了近幾年發(fā)展較快的幾種高效、經(jīng)濟(jì)、適合規(guī)?；苽涞纳锓蛛x方法，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的工作，現(xiàn)提出一種規(guī)?；苽湓逅{(lán)蛋白的方案(圖1)。該方案采用高壓細(xì)胞破碎技術(shù)處理樣品，處理后的溶液流經(jīng)擴(kuò)張床吸附層析柱，洗脫得到藻藍(lán)蛋白富集液;然后用藻藍(lán)蛋白富集液與PEG、鹽配制雙水相體系，吸取藻藍(lán)蛋白所在液相液體后經(jīng)超濾處理，得到的溶液凍干成藻藍(lán)蛋白粉。

圖1 規(guī)?；苽湓逅{(lán)蛋白的方案Fig.1 Scheme of the production of phycocyanin in large scale

我國螺旋藻干粉年產(chǎn)量近萬噸，超過全球總產(chǎn)量的50%，這為藻藍(lán)蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)提供了原料支持。目前我國螺旋藻產(chǎn)業(yè)以銷售螺旋藻原粉、膠囊、片劑為主，產(chǎn)品深加工程度低。以螺旋藻為原料，提取制備藻藍(lán)蛋白以及其他活性成分，增加產(chǎn)品附加值，豐富產(chǎn)品種類，促使產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型升級是擺在政府工作者、企業(yè)家以及科研工作者面前的具有重大創(chuàng)新意義及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的課題。

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