立體選擇性脂肪酶的篩選及其在薄荷醇拆分中的應用

徐 剛，李 牧，孫苗苗，吳堅平，楊立榮

(浙江大學 化學工程與生物工程學系，杭州 310027)

L－薄荷醇是全球銷量最高的香料之一，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、衛(wèi)生以及化妝品行業(yè)。然而，天然的L－薄荷醇產(chǎn)量與品質(zhì)受天氣與種植地域的影響較大，無法滿足市場需求?；瘜W合成的薄荷醇以4對薄荷醇(DL－新薄荷醇、DL－異薄荷醇、DL－薄荷醇與DL－新異薄荷醇)混合物的形式存在。其中，L－薄荷醇具有最高的清涼與陣痛功效，其他幾種薄荷醇如D－薄荷醇的口感與氣味較差，嚴重影響了化學合成產(chǎn)品的質(zhì)量［1］。因此，有必要針對化學合成產(chǎn)物進行拆分以制備高純度的L－薄荷醇。

化學催化是制備L－薄荷醇的主要方法［2］。但是，化學催化過程存在環(huán)境污染與高能耗的問題。與此同時，生物催化劑以其低能耗、低成本、原子經(jīng)濟性和更短的合成路線受到越來越多的關(guān)注。脂肪酶作為一類重要生物催化劑，具有較高的穩(wěn)定性、不需要輔助因子、底物譜廣泛與較高的立體選擇性等特點，成為工業(yè)用酶的研究熱點之一。目前已有一些關(guān)于脂肪酶用于薄荷醇拆分過程的報道［3－4］，但底物主要局限于 DL － 薄荷醇，與實際應用存在一定差距。因此，篩選能夠直接以4對薄荷醇為底物進行高效拆分的高立體選擇性微生物脂肪酶，成為工業(yè)應用的關(guān)鍵步驟。

筆者主要利用雙平板透明圈法，從93個產(chǎn)脂肪酶微生物中篩選得到1株高選擇性脂肪酶產(chǎn)生菌——產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas)，其所產(chǎn)脂肪酶對L－薄荷醇丙酸酯表現(xiàn)出較高的立體選擇性與催化活力。本文對脂肪酶催化拆分4對薄荷醇的最適條件以及底物特異性進行研究，以期為其生產(chǎn)應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土樣采集

土樣采自杭州蕭山化工廠附近受油污污染的土壤，取地表下10～20 cm深的濕潤土樣，4℃封存待用。

1.1.2 主要試劑

對硝基苯酚脂乙酸酯、硝基苯酚脂丁酸酯、硝基苯酚脂辛酸酯、硝基苯酚脂月桂酸酯、硝基苯酚脂油酸酯、三丁酸甘油酯、L－薄荷醇與DL－薄荷醇購自美國Sigma公司;乙腈、二甲基亞砜(DMSO)等均為國產(chǎn)試劑級純度;DNA聚合酶購自美國Fermentas公司。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏3，K2HPO41。用NaOH調(diào)至pH為7.2。三丁酸甘油酯、L－薄荷醇丙酸酯與4對薄荷醇丙酸酯用聚乙二醇(PEG)乳化后過濾除菌(0.22 μm)，分別以2%質(zhì)量分數(shù)加入上述培養(yǎng)基待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):橄欖油10，Tween－80 5，蛋白胨10，酵母膏 5，K2HPO41，無水 MgSO40.2。用NaOH調(diào)至pH為7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種初篩

將采集的土樣0.1 g用無菌水100 mL溶解，以5%接種量接種到含有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)24 h。取液體培養(yǎng)物用無菌水稀釋至10－6、10－7和10－8倍，均勻涂布在三丁酸甘油酯篩選平板上，30℃下培養(yǎng)24～48 h，將具有水解圈的單菌落分別挑至含有L－薄荷醇丙酸酯和4對薄荷醇丙酸酯的篩選平板。在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。觀察水解圈大小，將初篩單菌落接種5 mL試管培養(yǎng)并保存菌種待用。

1.2.2 菌種復篩

將初篩菌種接種到50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖床轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)24 h。12 000 r/min離心5 min除去菌體，取上清液(保存于4℃)作為待測粗酶。加入50 mmol/L終濃度的4對薄荷醇丙酸酯底物，37℃下反應5 min，用等體積的正己烷與之劇烈混合，移取正己烷并用無水Na2SO4脫水，進行氣相色譜分析。對映體過量值(e.e.p)與非對映體過量值(d.e.p)按文獻［5］計算，絕對轉(zhuǎn)化率 =L－薄荷醇質(zhì)量濃度/初始L－薄荷醇丙酸酯質(zhì)量濃度×100%。

1.2.3 菌種鑒定

反復劃線分離單菌落之后，培養(yǎng)并收集新鮮微生物菌體，用16sDNA通用引物克隆該細菌的16sDNA片段，通過堿基測序并在NCBI上比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，鑒定微生物的種屬關(guān)系。

1.2.4 脂肪酶活力測定

脂肪酶水解對硝基苯酯的過程，在405 nm吸收波長下被分光光度計測量。底物對硝基苯酚辛酸酯溶解于乙腈中，儲存濃度20 mmol/L。在酶活測定中，取20 μL底物儲存液，加入到0.96 mL的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液PBS(pH=8.0)中，35℃預熱10 min，然后加入20 μL同樣預熱的粗酶液開始反應。反應條件為35℃下5 min。酶活單位定義為每分鐘水解生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量［5］。

1.2.5 溫度對脂肪酶活性影響測定

在20～60℃ (間隔10℃)下，測定酶活力，以確定最適反應溫度。將初始酶液分別置于20、30、40、50和60℃中分別保溫30 min，測定剩余酶活，以開始時的酶活力為100%，計算相對活力，以確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.6 pH對脂肪酶活性影響測定

測定酶在不同pH緩沖液(pH 6.0～11.0)中的酶活力(其中 pH為6.0～7.0用50 mmol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，pH為7.0～9.0用50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液，pH為9.0～11.0用50 mmol/L的Gly－NaOH緩沖液)，以確定酶的最適反應pH。

將酶置于不同pH(5.0～11.0，間隔1.0單位)緩沖液，4℃放置24 h后，于35℃、50 mmol/L、pH 9.0的Gly-NaOH緩沖液中反應測定酶活，以酶活力最高點的相對酶活力為100%，確定pH穩(wěn)定性。

1.2.7 脂肪酶對對硝基苯酚酯類的底物偏好性

選擇不同長度的脂肪酸(C2～C16)對硝基苯酯為底物，測定最適底物。酶活測定方法同1.2.4部分。

1.2.8 對薄荷醇丙酸酯拆分研究

薄荷醇酯拆分結(jié)果在氣象色譜儀上分析測試。將4對薄荷醇丙酸酯溶于DMSO待用。向粗酶液2 mL中加入終濃度為50 mmol/L 4對薄荷醇丙酸酯底物，于35℃反應，氣相檢測拆分效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙平板透明圈法初篩

被脂肪酶菌株水解后，L－薄荷醇丙酸酯篩選平板與4對薄荷醇丙酸酯篩選平板中產(chǎn)生了透明圈，但由于立體選擇性的差異，選擇性較好的微生物在2塊平板上水解底物的速度不一樣，因此，L－薄荷醇丙酸酯平板與4對薄荷酯平板上的透明圈濁度差別越大，選擇性越強。據(jù)此方法，從土樣中初篩出11株具有明顯選擇性的菌株，待進一步復篩。

2.2 菌種復篩及種屬關(guān)系的鑒定

經(jīng)培養(yǎng)后，測定含有脂肪酶的上清液酶活達到174.2 U/L(以硝基苯酚辛酸酯為底物);當粗酶液水解拆分DL－薄荷醇丙酸酯的反應轉(zhuǎn)化率達到50%以上時，測定其選擇性。其中，選擇性最好的一株微生物所產(chǎn)的胞外水解酶，在絕對轉(zhuǎn)化率較高(＞30%)時，e.e.p＞99%。將該微生物的16S rDNA 測序并在NCBI上BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)堿假單胞菌的同源性大于98%，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖1)，確定該微生物是產(chǎn)堿假單胞菌Pseudomonas alcaligenes。

圖1 產(chǎn)堿假單胞菌進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Pseudomonas alcaligenes and closely related strains

2.3 溫度對脂肪酶活力的影響

反應溫度是酶催化的重要影響因素之一。在pH 9.0 Gly－NaOH緩沖液體系中，測定溫度對酶活的影響(圖2)。由圖2可知:酶在30～35℃時具有較高的活性，在35℃活性達到最高。與Psuedomonas sp.KB700A［6］、Psuedomonas sp.S5［7］和P.fluorescens MC50［8］所報道的脂肪最適反應溫度一致，在35℃左右。

圖2 溫度對脂肪酶活性的影響Fig.2 Effects of temperatures on Pseudomonas alcaligenes lipase

酶的熱穩(wěn)定性受很多因素影響，如氨基酸組成、二硫鍵、疏水作用、離子對、多聚體和α－螺旋的雙電極穩(wěn)定化作用等。圖2表明該酶在30℃以下具備較好的穩(wěn)定性，超過40℃快速失活。40℃條件下，放置30 min，殘余酶活只有18%。當溫度大于60℃時，脂肪酶基本失活。因此綜合酶的反應活性與熱穩(wěn)定性，選擇35℃為最適溫度。

2.4 pH對脂肪酶活力的影響

在最適溫度下，考察最適反應pH，結(jié)果見圖3。圖3表明最適反應pH為9.0，且發(fā)現(xiàn)該酶在pH 8.0～11.0時均具有較佳的酶活力，活力最高維持在pH 9.0附近。將置于不同的pH緩沖條件下的酶在4℃放置24 h，測定殘余酶活，結(jié)果顯示該酶在pH 6.0～11.0時具有較佳的穩(wěn)定性。脂肪酶在范圍較廣的pH范圍內(nèi)都保持較佳的穩(wěn)定性。與報道的Pseudoalcaligenes F －111［9］脂肪酶pH 穩(wěn)定性(pH 6.0 ～10.0)相似。

2.5 脂肪酶對對硝基苯酚酯類的底物特異性

圖3 pH對脂肪酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on Pseudomonas alcaligenes lipase

以不同碳鏈長度的對硝基苯酯為底物，考察了產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶的底物特異性，結(jié)果見圖4。由圖4可知:該酶對不同長度的對硝基苯酯底物的均能表現(xiàn)出活性，在催化pNPC8水解時表現(xiàn)出最大的活力。酶對 pNPC2、pNPC4、pNPC12和2pNPC16都表現(xiàn)出一定程度的水解活性。

圖4 脂肪酶底物特異性Fig.4 Substrate specifity of Pseudomonas alcaligenes lipase

由圖4還可知:脂肪酶對中等鏈長的對硝基苯酚辛酸酯pNPC8的水解能力最強且底物范圍較窄。對 C2、C4底物的酶活僅為 2%、4%，對 C12、C16的底物酶活僅為42%、11%。因此，該脂肪酶雖然催化長鏈脂肪酸甘油酯的水解能力較弱，但相比短鏈底物具有長鏈偏好性，所以應該屬于脂肪酶。

2.6 脂肪酶對4對薄荷醇丙酸酯的拆分

脂肪酶能選擇性水解4對薄荷醇丙酸酯混合物中L－薄荷丙酸酯為L－薄荷醇。水解反應在水相中進行，反應結(jié)束后用正己烷萃取，萃取率大于95%。氣相分析表明:該酶具備較高的產(chǎn)物e.e.p值，隨著有效轉(zhuǎn)化率的上升，重組酶一直保持很高的產(chǎn)物e.e.p值，但d.e.p不斷下降。當絕對轉(zhuǎn)化率達到50%時，對映體過量值大于99%，D－薄荷醇丙酸酯幾乎不被水解，非對映體過量值大于90%，主要原因是L－新異薄荷醇被少量水解，導致產(chǎn)物純度下降。

3 結(jié)論

采用雙平板透明圈法初篩，氣相色譜復篩的篩選模型，從土樣中篩選得到一株高立體選擇性脂肪酶菌株產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。通過油脂誘導培養(yǎng)基發(fā)酵，對獲得的粗酶進行了酶學性質(zhì)測定。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶最適溫度為35℃，30℃以下相對穩(wěn)定;最適pH在9.0，穩(wěn)定范圍比較寬，為pH 6.0～11.0。拆分4對薄荷醇丙酸酯具有較高的選擇性，絕對轉(zhuǎn)化率50%時，發(fā)現(xiàn)e.e.p大于 99%，d.e.p大于 90%。因此產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶具有廣闊工業(yè)應用前景。

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