柱前衍生-高效液相色譜熒光法測(cè)定人血漿中乙酰半胱氨酸及其生物等效性研究

張 樂(lè)，胡嵐嵐，周世文，湯建林

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，重慶 400037）

0 引 言

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種巰基化合物，作為關(guān)鍵的生理物質(zhì)廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞和組織中。NAC不僅在細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)方面發(fā)揮重要功能，而且具有多種藥理作用，比如：溶解黏液，抗氧化，消炎，保護(hù)肝臟、心臟和神經(jīng)細(xì)胞等[1-2]。NAC的臨床應(yīng)用領(lǐng)域還在不斷拓寬，在藥物及重金屬中毒、腫瘤、艾滋病、帕金森病等過(guò)程中NAC都能起到一定預(yù)防、治療作用[3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于巰基化合物測(cè)定方法的報(bào)道較多，包括熒光光度法[4]，氣相色譜質(zhì)譜法[5]，離子色譜法[6]和高效液相色譜-紫外[7]、質(zhì)譜[8]或電化學(xué)檢測(cè)法等。但上述方法在分析性能，成本，操作復(fù)雜性，樣品處理，靈敏度等方面多存在著種種不足。這些不足大大增加了實(shí)驗(yàn)難度或成本，導(dǎo)致上述檢測(cè)方法難以應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)和推廣。同時(shí)，有研究表明，熒光試劑衍生高效液相色譜熒光分析法在測(cè)定巰基化合物含量時(shí)，具有靈敏度高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化，特異性高等特點(diǎn)。據(jù)此，本研究采用 N-（1-芘） 馬來(lái)酰亞胺 （N-（1-Pyrenyl）maleimide，NPM）為熒光衍生試劑，設(shè)計(jì)、建立了柱前衍生-高效液相色譜熒光分析方法，用于人血漿中NAC濃度的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters-600E型高效液相色譜系統(tǒng)（配2475型熒光檢測(cè)器，717plus型自動(dòng)進(jìn)樣器及Millennium32色譜管理軟件，Waters公司）；色譜柱：Diamonsil C18柱（5μm×150mm×4.6mm，系列號(hào) 8013909，迪馬公司）；保護(hù)柱：C18柱芯（4mm×3.0mm，迪馬公司）；MC-210S型電子天平（精度0.01mg，Sartorius公司）；高速離心機(jī)（Abbott公司）；XH-86多用途旋渦混合器（江蘇阜寧縣羅橋校辦工廠）；Millipore超純水系統(tǒng)。

受試制劑：乙酰半胱氨酸咀嚼片（海南海神同洲制藥有限公司，規(guī)格：0.6g/片，批號(hào)：20071101）；參比制劑：乙酰半胱氨酸泡騰片（浙江康恩貝生物制藥有限公司，規(guī)格：0.6g/粒，批號(hào)：070828）；乙酰半胱氨酸對(duì)照品（純度99.5%，批號(hào)：20031001，海南海神同洲制藥有限公司）；N-（1-Pyrenyl）maleimide（NPM，含量 98%，Sigma公司）；Tetramethylammonium hydroxide pentahydrate（TMA，含量 98%，Alfa Aesar試劑，Johnson Matthey公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（Burdick＆ Jackson公司）；磷酸（分析純，重慶川東化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鈉（分析純，重慶北碚化學(xué)試劑廠）；三乙胺（含量≥99.5%，F(xiàn)luka公司），試驗(yàn)用水均為Millipore超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 流動(dòng)相的配制

精密稱取0.78 g磷酸二氫鈉于500mL容量瓶中，用超純水定容，即得10mmol/L溶液，經(jīng)0.45μm的水性濾膜過(guò)濾后于室溫保存即可。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取NAC 6.4mg，用乙腈溶解定容至50mL，即得128μg/mL的NAC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精密稱取NPM 44.7mg，用乙腈溶解定容至100mL，即得1.5mmol/L NPM儲(chǔ)備溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取NAC儲(chǔ)備液用乙腈對(duì)半稀釋至濃度分別為 64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；取上述1.5mmol/L NPM溶液1mL于50mL容量瓶中，乙腈定容至即得30μmol/L NPM衍生溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血漿樣品的處理及衍生化反應(yīng)

取血漿樣品100μL于1.5mL離心試管中，加入800μL NPM衍生液，渦旋1min，室溫反應(yīng)5min后，加50%乙酸中止反應(yīng)，10500 r/min離心3min，取上清20μL進(jìn)樣。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱；流動(dòng)相：乙腈－10mmol/L NaH2PO4（含TMA 10mmol/L，H3PO4調(diào)pH至3.4）為50∶50。流速：1mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：330nm，發(fā)射波長(zhǎng)：380nm；柱溫：30℃。進(jìn)樣量為20μL。

1.2.5 方法驗(yàn)證

本文對(duì)高效液相色譜熒光法進(jìn)行了線性、定量下限、精密度、回收率、穩(wěn)定性的驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 分離特性

在上述色譜條件下，分別考察了7個(gè)不同來(lái)源的空白血漿，空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)測(cè)樣品的色譜分離情況，測(cè)得NAC色譜圖如圖1所示。由圖可見(jiàn)，被測(cè)物峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，血樣中NAC的保留時(shí)間為3.8min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

取上述配置好的NAC工作液50μL于0.95mL血漿中，按血漿處理方法配制成血漿濃度為：6.58，3.29，1.64，0.82，0.41，0.20，0.10 μg/mL 的溶液進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度平行2份。每一濃度進(jìn)樣20μL。記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝9.91×105x+4.47×104（r=0.9945，n=3，各點(diǎn) RSD＜12%，見(jiàn)表 2），線性范圍為 0.1～6.58μg/mL，血漿中 NAC 定量下線為 0.1μg/mL（S/N=5，0.101±0.002，RSD=2.3%，n＝5）。

2.3 回收率試驗(yàn)

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各 5份，按照1.2.3“血漿樣品處理”項(xiàng)下步驟操作，進(jìn)樣分析，計(jì)算得低、中、高3種濃度的NAC的相對(duì)回收率（n=6）分別為94.8%、93.1%、90.7%；變異系數(shù)分別為3.8%、8.7%、6.0%。結(jié)果表明，低、中、高3種濃度的相對(duì)回收率均符合要求，方法準(zhǔn)確可靠。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 精密度試驗(yàn)

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各 5份，按照1.2.3操作，在1 d內(nèi)不同時(shí)間處理測(cè)定，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d于同一時(shí)間配制0.20，1.64，6.58μg/mL NAC血樣各5份，處理測(cè)定，考察日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乙酰半胱氨酸精密度試驗(yàn)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 血漿樣品處理后室溫放置的穩(wěn)定性

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各兩份，-80℃冰箱放置凍存，按照1.2.3“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，于 0，1，2，3，4，6，12h 測(cè)定，每個(gè)濃度平行 2份。考察血漿樣品處理后室溫放置的穩(wěn)定性，其結(jié)果見(jiàn)表3。由表可見(jiàn)，血漿樣品可于室溫下至少保存12h（RSD＜11.3%）。

2.5.2 凍融穩(wěn)定性

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各兩份，-80℃冰箱放置凍存，然后在室溫融化，融化后的樣品在同樣條件下重新冷凍。按照1.2.3操作，于每個(gè)凍融循環(huán)測(cè)定，每個(gè)濃度平行兩份?？疾?次凍融循環(huán)血樣的穩(wěn)定性，其結(jié)果見(jiàn)表3。由表可見(jiàn)，血漿樣品凍融3次仍穩(wěn)定（RSD＜12.8%）。

2.5.3 血漿樣品冰箱凍存的長(zhǎng)期穩(wěn)定性

配制 0.20，1.64，6.58μg/mL NAC 血樣各 14份，-80℃冰箱放置凍存，按照1.2.3操作，于0，1，2，3，6，7，10 d 測(cè)定，每個(gè)濃度平行兩份?？疾煅獫{樣品長(zhǎng)期凍存的穩(wěn)定性，其結(jié)果見(jiàn)表3。由表可見(jiàn)，血漿樣品可于-80℃冰箱至少保存10d（RSD＜12.6%）。

表3 乙酰半胱氨酸穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6 實(shí)測(cè)樣品結(jié)果

男性健康受試者20名，完全隨機(jī)分成兩組，每組10人，分兩個(gè)階段采用雙交叉給藥方案，分別口服被試制劑和參比制劑 1.2g，于給藥前和后 15，30，45，60，75min，1.25，1.5，2，2.5，3，4，6，8 h 抽取上肢靜脈血3mL，分離血漿，柱前衍生-HPLC熒光檢測(cè)法測(cè)定人血漿中NAC濃度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)BECS軟件處理，統(tǒng)計(jì)分析。20名受試者口服參比之際和受試制劑1.2g后，NAC不同制劑的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖見(jiàn)圖2。

受試制劑與參比制劑NAC的Tmax分別為（1.35±0.59），（1.47±0.72）h，Cmax分別為（3.76±1.35），（3.80±1.48）μg·mL-1，用梯形法計(jì)算所得的 AUC0-t分別為（8.13±2.35），（8.40±2.23）μg·h·mL-1，AUC0-∞分別為（9.62±2.60），（10.03±2.64）μg·h·mL-1。對(duì)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)T檢驗(yàn)及90%可信限判斷，受試制劑的Cmax落在參比制劑的80.39%～123.99%范圍內(nèi),受試制劑的AUC0-t落在參比制劑的82.70%～112.20%范圍內(nèi)，AUC0-∞落在參比制劑的83.14%～111.16%范圍內(nèi)，對(duì)Tmax經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)，無(wú)顯著差異，受試制劑NAC咀嚼片AUC0-t的相對(duì)生物利用度為（101±34）%，AUC0-∞ 為（103±40）%，符合生物等效性規(guī)定要求。

圖2 20名健康受試者分別口服1.2g受試制劑和參比制劑后乙酰半胱氨酸血藥濃度均值-時(shí)間曲線

3 結(jié)束語(yǔ)

曾經(jīng)使用高效液相熒光法測(cè)定人血漿中NAC含量，試用了固相萃取法處理血漿樣品或調(diào)整流動(dòng)相比例的辦法用以克服空白血漿對(duì)樣品測(cè)定的干擾，但效果不佳。故在隨后的實(shí)驗(yàn)中選擇柱前衍生高效液相熒光法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，在此條件下，雜質(zhì)峰對(duì)樣品峰干擾小，保留時(shí)間適宜。

NAC本身是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，其分子式中的活性巰基（-SH）很容易被氧化為二聚物或與生物基質(zhì)中的內(nèi)源性巰基以混合二聚物形式存在。因此，NAC在生物樣品中不穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)NAC的血漿樣品在－80℃冰箱中保存6h后，NAC含量發(fā)生明顯改變；在室溫條件下放置1 h后，含量也開(kāi)始降低。鑒于此，需要引入一種衍生試劑，通過(guò)衍生反應(yīng)增強(qiáng)NAC在生物樣品中的穩(wěn)定性。NPM作為一種衍生試劑，與巰基的衍生步驟非常簡(jiǎn)單（不需要任何特殊試劑，反應(yīng)在室溫下孵育5min即可完成），且衍生后的樣品相對(duì)穩(wěn)定。衍生化反應(yīng)式見(jiàn)路線圖3。因此，在實(shí)驗(yàn)中選擇了NPM對(duì)獲得的血漿樣品立即進(jìn)行衍生化處理，并將衍生后的樣品在-80℃條件下保存。隨后，在10日內(nèi)完成檢測(cè)。

圖3 NAC衍生化反應(yīng)式

試驗(yàn)結(jié)果表明，本法符合化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則。且本法簡(jiǎn)便易行，靈敏度較高，重現(xiàn)性好,生物樣本中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定不產(chǎn)生干擾，可用于該藥的生物樣本中含量的測(cè)定。

通過(guò)對(duì)20名健康志愿者采用隨機(jī)、雙交叉試驗(yàn)，比較NAC咀嚼片及泡騰片的相對(duì)生物利用度。結(jié)果顯示，NAC咀嚼片和泡騰片各主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著性差異，認(rèn)為受試制劑與參比制劑間具有生物等效性。

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