恩拉霉素含量測定方法的改進

朱曦 董文婷 胡深 梁利妺

摘要：針對《進口獸藥質量標準》1999年版收錄的恩拉霉素預混劑含量測定方法中部分檢測條件進行了適當的改進，將pH 4.0醋酸鹽緩沖液改為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液，檢驗用菌株改為金黃色葡萄球菌，培養(yǎng)基改為Ⅱ號pH 7.8的培養(yǎng)基，終濃度由10～40 U/mL改為100～400 U/mL，由振搖30 min改為超聲提取90 min。優(yōu)化了檢驗條件，使檢驗結果更精準可靠。

關鍵詞：恩拉霉素；效價測定；微生物檢定法

中圖分類號：S859.79+6 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）06-0015-02

恩拉霉素（Enramycin）是由放線菌（Streptomyces fungicidicus）發(fā)酵而得，其包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機堿。其中氨基酸分子構成環(huán)狀多肽結構，脂肪酸位于多肽結構末端，據其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素 A（C107H138Cl2N26O31）和恩拉霉素B（C108H140Cl2N26O31）。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，如梭狀芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等革蘭氏陽性菌均具有很強的抑制作用。尤其是對梭狀芽孢桿菌（Clostridium）作用更加顯著。恩拉霉素不同于其他抗生素的是長期使用后不容易產生耐藥性，并能促進豬、雞增重和提高飼料轉化率。

目前國內獸藥恩拉霉素含量測定方法的依據為中國農業(yè)部發(fā)布的1999年版《進口獸藥質量標準》。依據恩拉霉素的藥理學特點，在實際檢測工作中對樣品提取、緩沖液及終濃度等檢測條件進行優(yōu)化，建立新的檢測方法，使得檢測條件更合理，結果更精準。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）試劑及培養(yǎng)基。冰醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、丙酮、鹽酸等試劑均為分析純。試驗用水為蒸餾水。pH 4.0醋酸鹽緩沖液按照1999年版《進口獸藥質量標準》提供方法配制[1]，pH 7.8的磷酸鹽緩沖液按照2010版的《中國獸藥典》一部附錄抗生素微生物檢定法配制[2]。抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅰ號pH 7.8、Ⅱ號pH 7.8均購于北京海淀中海動物保健科技公司。

（2）菌種及標準品?？莶菅挎邨U菌[CMCC（B）63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。標準品由武漢興鼎生物科技公司提供，標示效價為1 216 U/mg。

（3）樣品4%的恩拉霉素預混劑由興鼎生物科技公司提供。

（4）儀器設備。TOMY ES310高壓滅菌器，干燥箱，恒溫水浴培養(yǎng)箱，ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀，移液槍（最大量程1 000 μL）。

1.2 試驗方法

（1）按文獻[2]分別制備pH 7.8培養(yǎng)基Ⅰ鋪加枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]菌懸液和pH 7.8培養(yǎng)基Ⅱ鋪加金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌懸液的雙碟備用。

（2）精密稱取標準品適量，按文獻[1]加提取液（丙酮：1mol/l鹽酸：水 =35：12：56），制成含1 000 U/mL的備用液，再分別用pH4.0的緩沖液與pH 7.8的磷酸緩沖液制成濃度分別為10、40 U/mL與 100、400 U/mL的兩組高低劑量溶液備用。取制備好的1.2（1）中兩種雙碟，分別滴加這兩組高低劑量的溶液，同時滴加上述兩種緩沖液做空白對照，（37±1）℃培養(yǎng)。

（3）按文獻[1]取本品適量，精密稱定樣品2.500 0 g，加提取液（丙酮：1mol/l鹽酸：水 =35：12：56），制成含恩拉霉素1 000 U/mL的溶液，充分振搖30 min，取上清液，用醋酸鹽緩沖液（pH4.0）稀釋成終濃度分別為10 U/mL和40 U/mL的溶液；按文獻[2]測定3批樣品的含量。

（4）精密稱定樣品2.500 0 g，加提取液（丙酮：1 mol/l鹽酸：水=35：12：56）約80 mL，水浴超聲40 min，冷至室溫，加提取液制成含恩拉霉素1 000 U/mL的溶液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.8） 稀釋成終濃度分別為10、40 U/mL與100、400 U/mL的兩組溶液；菌懸液菌株為金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕，培養(yǎng)基為Ⅱ號pH7.8，其他檢測條件不變，按文獻[2]方法測定3批樣品的含量。

（5）在1.2（4）基礎上將樣品超聲提取時間分別設定為10 、20 、40 、60 、90 min，終濃度為100和400 U/mL的溶液，其他檢測條件不變，按文獻[2]方法測定3批樣品的含量。

2 結果與分析

（1）按文獻[1]所載方法，在pH7.8培養(yǎng)基Ⅰ鋪加枯草芽孢桿菌菌懸液的雙碟上滴加醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）做為試驗空白對照，培養(yǎng)結果產生明顯的抑菌圈。滴加的標準溶液高、低濃度形成的抑菌圈平均差值小于1，劑間差異不明顯。按改進方法的pH 7.8培養(yǎng)基Ⅱ鋪加金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌懸液的雙碟上滴加pH 7.8的磷酸緩沖液為空白的雙碟，培養(yǎng)結果無抑菌圈。劑間高低濃度為10 U/mL和40 U/mL的溶液形成的抑菌圈與文獻[1]方法相比稍好，但大小抑菌圈平均差值小于1。劑間濃度為100 U/mL和400 U/mL的溶液形成的抑菌圈大小圈差值大于2且小于3.5，劑間差異較明顯（表1）。

（2）按文獻[1]和改進方法測樣品含量，由表2可見，文獻[1]所載方法由于劑間差異不顯著，所得抑菌圈數據不符合獸藥檢驗操作規(guī)程，檢測結果無效。方法改進后可得到較為準確的檢驗結果。

（3）方法改進后，所使用的超聲提取時間對結果的影響見表3。由表3可見，劑間濃度為100 U/mL和400 U/mL，經過超聲提取，超聲時間對檢測結果也有一定的影響，超聲提取時間在10～40 min期間，超聲時間越長檢測結果越高，說明延長超聲時間可以充分提取樣品。但超聲時間超過40 min后特別是到90 min時，提取結果反而下降，說明超聲40 min就可完全提取樣品。

3 討論

（1）原方法中所用醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）在一定程度上抑制方法中枯草芽孢桿菌的生長，使得空白醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）也能產生抑菌圈。而抗生素微生物檢定管碟法的原理是在鋪加一定量菌懸液的瓊脂平板上，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。由于抑菌圈的大小與檢測結果相關，本法所用的稀釋液、緩沖液不能有抑菌或殺滅病菌的作用。而文獻[1]所載檢測方法使用的醋酸鹽緩沖液（pH4.0）影響了恩拉霉素正常的抑菌圈的大小，掩蓋了其真實的抑菌作用，使檢測結果有誤 ，此方法不適用于檢測恩拉霉素的效價。而改進后的方法避免了此類問題，所用菌株對恩（下轉第 21 頁）

（上接第 16 頁）

拉霉素敏感，緩沖液對菌株無抑制或殺滅作用。

（2）文獻[1]所載檢測方法中振搖提取30 min，在實際檢測中發(fā)現超聲更利于提取，且超聲時間對其結果有一定的影響，在超聲40 min時就可完全提取主藥成分，因此采用超聲提取要比振搖更能得到真實準確的檢測結果。

（3）文獻[1]所載檢測方法，上碟濃度范圍為10 U/mL和40 U/mL。改進后的方法上碟濃度范圍改為100 U/mL和400 U/mL，用原方法檢測發(fā)現使用該濃度范圍，即使加菌量減小所形成的抑菌圈依然偏小，達不到文獻[2]規(guī)定的標準品高濃度抑菌圈直徑范圍應在18～22 mm的要求，影響結果的準確性。而改進后標準品高濃度抑菌圈直徑范圍在18～22 mm之間，且大小圈差異明顯，符合文獻[2]要求，使得檢測結果更精準。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國農業(yè)部《進口獸藥質量標準》（1999年版）[S].

[2] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2010年版一部）[M].北京：中國農業(yè)出版社，2011.