臨床轉化應用中有關脂肪源性干細胞獲取需要解決的問題

周天恩　劉宏偉

目前，有關脂肪源性干細胞（Adipose—derived stem cells，ADSC）的分離和提取主要以Zuk等提出的方法為藍本（見表1），進行改進形成各自使用的實驗步驟。由于實驗室分離、提取多用于基礎研究，當中獲取細胞的過程多數(shù)未能顧及臨床應用時所考慮的問題，如：傳播動物源性疾病的風險、生產(chǎn)的時間、治療的成本等。然而，轉化醫(yī)學“From Bench to Bedside”的目標就是將實驗室研究的成果應用于臨床創(chuàng)造新的療法。在此之前，必須透徹地分析每個處理細胞的步驟是否會對人體存有潛在的危害，用起來是否經(jīng)濟、是否簡便易于操作等，以便新的療法能夠服務于大眾的醫(yī)療需求。本文綜合動物及人體來源提取脂肪源性干細胞

（Adipose-derived stem cells，ADSC）的過程，從ADSC分離、提取、擴增三方面進行剖析，以期為臨床轉化應用提供參考。

1 脂肪源性基質(zhì)血管組分（SiromaJ vascularfraction，SVF）的分離步驟存在的問題

從脂肪組織分離SVF，使用的酶種類及其濃度的關系還沒有完整的研究報道?？梢杂糜谙窘M織的酶有膠原酶、分散酶、透明質(zhì)酸酶等，以膠原酶最為廣泛使用，使用的濃度有0.01%、0.075%、0.05%，尚未有統(tǒng)一。陶凱等為了了解不同膠原酶濃度、膠原酶消化時間和血清濃度對于人脂肪來源干細胞體外培養(yǎng)的不同效果，采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四種不同膠原酶濃度進行消化，最后結果是在消化1h時，2.0mg/ml組消化細胞總數(shù)最多，提示消化過程中有濃度依賴性。陳超等曾評價不同的細胞對不同酶的耐受性不同，因此，必須把握酶消化的酶濃度與消化時間，提高分離細胞的純度與存活率。如：觀察組織塊已經(jīng)分散而失去塊的形狀，形成細胞一酶混合液，可以認為已消化充分。如果消化時間過長，培養(yǎng)瓶中的組織塊就會變成細胞碎片。

酶消化法的另一缺點就是存在細胞毒性，一般的消化酶有可能包含內(nèi)毒素、其他的蛋白酶、異種蛋白。針對此問題，目前研究了幾種非酶性的細胞分離法，如：熒光激活細胞分選法（Fluorescence—activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、使用涂有特異性抗體的免疫磁珠篩選法（Immunomagnetic-bead purification）、乙醛脫氫酶的選擇表達法等。這些方法雖然避免了消化酶的細胞毒性問題，卻帶來了過高的研究成本，不便于臨床大量使用。因此，現(xiàn)有的分離法，除了要考慮是否符合GMP/GCP指南的要求，還需要更多實用的應用實驗使之在實踐中逐步完善。

2 正確提取ADSC在轉化醫(yī)學的意義

迄今為止，研究報告指出影響ADSC提取的因素大致可分為六個方面：脂肪老化程度，脂肪細胞的活性隨著患者的年齡下降，能提取ADSC的量相對減少；對吸脂部位，人體不同部位囤積的脂肪含量有別，較容易囤積脂肪的地方，如：腹部、大腿均能有效提取所需的ADSC：脂肪提取組織的粉碎程度，不同的抽脂方法會影響脂肪組織的粉碎程度，脂肪組織越細，膠原酶才能更有效消化脂肪組織并提取更多ADSC；濃度離心速度，研究表示高速離心會降低ADSC活性，但最理想的離心速度到目前為止并沒有確切的方案：SVF的凈度，抽脂后大量血細胞及纖維組織粘附在脂肪表面，雖然沒有臨床證據(jù)證明這些組織會妨礙ADSC成長，但屬貼壁性生長的ADSC在體外實驗中顯示大量倍增需要純凈的環(huán)境；細胞存儲方法，不同的降溫速度及冷凍試劑都對ADSC的活性有影響，要減低對ADSC的損害并將之發(fā)展為醫(yī)療產(chǎn)業(yè)，必須積極研究有效獲取ADSC的方法。

以上因素當中跟轉化醫(yī)學關系最為密切的，就是SVF的凈度。從脂肪組織分離SVF后，一般實驗室會使用生理鹽水（PBS）或紅細胞裂解液沖洗SVF，將多余的紅細胞去除免得其妨礙ADSC的貼壁生長，從而提高所提的ADSC的純度。Horn等的研究示，使用含氯化銨的紅細胞裂解液相比單核細胞密度分離更快捷提取間充質(zhì)干細胞

（mesenchymal stemcells，MSC）。報告指出，經(jīng)離心法初步分離出來的MSC混合了不同類型的基質(zhì)細胞，要找出方便、有效獨立提取ADS的方法才能減少增殖時間，迅速達到適合臨床應用的細胞量。

使用氯化銨裂解液的唯一缺點就是氯化銨具細胞毒性，所以通過其提取的ADSC有可能存在違背臨床轉化應用的主旨。雖然說明氯化銨對人體有何直接影響的臨床報道并不多，但曾經(jīng)有研究指出經(jīng)過氯化銨裂解后提取的ADSC存活力不高，因此，許多針對臨床研究的實驗室都直接放棄裂解的部分。針對紅細胞裂解液在臨床使用的安全性的研究并不多，礙于氯化銨的毒性始終對人體細胞有潛在的安全威脅，對ADSC的存活力可能潛在的不良影響，要兼顧ADSC的提取效率，必須另覓有效且安全性較高的紅細胞裂解液。

最近，于春艷等的研究提出氯化銨對人體內(nèi)的自噬一溶酶體系統(tǒng)的活動有不良影響。當體內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)，包括細胞內(nèi)由于生理或病理原因而被損傷的細胞器，或過量儲存的糖元等，它們可被細胞自身的膜（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基復合體的膜）包裹形成自噬體（autophgosome），形成內(nèi)源性物質(zhì)囊泡。而自噬體與初級溶酶體接觸后，兩者將融合形成自噬溶酶體。該實驗顯示，透射電鏡觀察可見在含氯化銨的環(huán)境下，自噬體與溶酶體并沒有完全融合，因此增加維生素K3誘導的細胞凋亡，同時伴有caspase非依賴細胞死亡途徑，確認了氯化銨的細胞毒性，以及可能誘發(fā)對人體有害的機制。另外，鞏文玉等研究也報道含氯化氨的紅細胞裂解液影響細胞的表面抗原蛋白的表示，尤其使CD34不能正常表達，影響細胞計數(shù)，暗示氯化銨的細胞毒性或許影響基因排序，導致蛋白反應異常。既然以上研究提出了氯化銨對細胞損害的證據(jù)，因此提取ADSC的方案必須顧及使用臨床認可并能安全體內(nèi)吸收的溶液與試劑，如：氯化鈉溶液。另外，除了研究紅細胞裂解的新方法，還應該積極探索其他提高ADSC純凈度的方法，如：多次沖洗或應用簡單的滲透原理減少多余的紅細胞。

3 體外培養(yǎng)ADSC主要面對的安全問題

3.1 動物源性疾病傳播的風險：胎牛血清（FoetalBovine Serum，F(xiàn)BS）被廣泛使用于ADSC擴增與分化的步驟中，但這種方法在理論上存在傳播動物源性傳染?。╞ovine spongiform encephalopathy，BSE）及導致血清病的風險。雖然研究表示新生牛血清跟胎牛血清培養(yǎng)基均對ADSC的質(zhì)量與產(chǎn)量有正面影響，但是FBS蛋白跟ADSC蛋白有可能在培養(yǎng)基中結合，到臨床使用時有機會傳播病毒或病毒性疾病、誘發(fā)異種免疫反應，甚至即時排斥的免疫反應，對患者的生命存在威脅。鑒于此類問題的存在，有研究報道提出使用人的血清或血小板源性產(chǎn)品作為培養(yǎng)基的可能性，目的是把細胞產(chǎn)品人源化以穩(wěn)定細胞產(chǎn)品的活力，同時杜絕動物源性疾病傳播的風險。

除此以外，科學家們正積極研究可否采用無血清的培養(yǎng)方法。無血清培養(yǎng)基（serum freemedium，SFM）顧名思義不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的合成培養(yǎng)基。由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子，如：纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞以懸浮形式生長。SFM不但可避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染，還可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細胞培養(yǎng)和實驗結果的重復性，有利于體外培養(yǎng)細胞的分化；缺點主要是成本高，以及懸浮細胞易受某些機械因素和化學因素的影響。

3.2 低溫儲存ADSC的潛在風險：液氮深低溫保存對ADSC擴增及分化能力沒有明顯影響。不過，有關如何最大限度保存ADSC的生物特性則有賴于合適的冷凍保護劑和對應的培養(yǎng)基。Martinello等在犬ADSC低溫賦存研究中證實長期保存（1年）并不影響ASCs的MSC特性，但會使ADSC的增殖率和端粒酶的活性降低；類似的結果也在大鼠及人ADSC中發(fā)現(xiàn)。為加快ADSC的臨床應用，必須有效長期保存ADSC能夠以供患者日后不時之需。常規(guī)冷凍法，又名逐步冷凍法，進行冷凍前需要在培養(yǎng)基中置入不同的冷凍保護劑，如：二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），不僅有細胞毒性，還能以時間依賴的方式誘導細胞走向凋亡（apoptosis）；解凍時則需要置入含血清的PBS徹底脫除冷凍保護劑，引申上述的動物源性疾病問題。不少研究比較不同的冷凍保護劑，也提出過新的保護劑取代DMSO，如：聚乙烯吡咯烷（polyvinylpyrrolidon，PVP），CELLBANKER2，但最近Miyamoto等表示最可行的保存ADSC的辦法，是在培養(yǎng)基中加入絲膠蛋白（sericin），因其含有豐富絲氨酸，在脂肪和脂肪酸的新陳代謝中發(fā)揮重要作用，解凍后的ADSC存活率高達95%。另外，也有研究使用開放式拉長塑料細管法保存ADSC?？墒瞧浯媪可伲词辜毎麖驮氏鄬^高，不適宜大規(guī)模應用。而且，開放式暗示細胞接觸液氮的機會率高，很容易造成污染，對日后使用者產(chǎn)生威脅。

上述方法雖然能應對目前ADSC的需求，可是要大量儲存以應對未來再生醫(yī)學的發(fā)展，必須更進一步研究低成本又方便存取的儲存方法，確保ADSC有穩(wěn)定性高的復原率和存活率，才能使患者受益。

3.3 缺乏標準化的實驗程序：細胞的生產(chǎn)程序必須確保細胞產(chǎn)品的重復性和可靠性，才能投入量化生產(chǎn)并使之應用普及。目前絕大多數(shù)實驗室使用幾個常規(guī)的步驟處理脂肪組織來源的細胞。這些步驟包括：PBS沖洗、酶消化或機械破碎脂肪組織、離心以便分離出可供直接使用或低溫貯藏的SVF，或者培養(yǎng)擴增以產(chǎn)生ASCs。雖然有關如何提取ADSC的理論越來越成熟，但是現(xiàn)有的研究必須考慮其出處是否符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good ManufacturePraetices，GMP），以及藥物臨床試驗管理規(guī)范（Good clinic Practices，GMP）實踐指南的要求。GMP/GCP要求嚴格登記細胞生產(chǎn)過程中的操作步驟，而且所使用的設備必須有合資格的認證，符合這兩個條件的研究成果的可信度和實際應用能力較高，相對臨床參考價值也更大。

目前，ADSC在人體的臨床應用還處于早期階段，缺乏循證醫(yī)學的證據(jù)。因此，實行大規(guī)模的臨床實驗前，有必要在早期的臨床研究中，有計劃地開展隨機雙盲對照實驗，為最終的循證醫(yī)學分析積累資料。這需要多中心研究單位共同協(xié)調(diào)與規(guī)劃，將有關ADSC的動物研究數(shù)據(jù)轉移到人體，找出ADSC于人體的相關指標，才能保證ADSC的安全應用，并有望普及以ADSC為基礎的細胞療法。

4 小結

雖然目前的技術都可以大規(guī)模擴增ADSC并保持其生物特性，但是臨床轉化應用ADSC必須盡最大可能避免潛在的危險性，防止誘發(fā)其他疾病或損害。實行患者利益導向政策，確保沒有產(chǎn)生后遺癥或副作用的操作工序，尋找快捷且低成本的方法獲取ADSC，使細胞治療能夠普遍應用，最終惠及民生。根據(jù)轉化醫(yī)學的原則，要把基礎研究成果轉化為可在臨床實際應用的產(chǎn)品，除了必須準確地判斷和預該產(chǎn)品的安全性及有效性，還需要在重復生產(chǎn)時達到一定的穩(wěn)定性，才能將創(chuàng)新的科研成果用作醫(yī)療手段。為此，需要全球各實驗室通力合作，制定一個規(guī)范的程序使其分離、提取、培養(yǎng)、儲存中每一個步驟都標準化以便監(jiān)管，逐漸使ADSC的生產(chǎn)標準化，避免研發(fā)投入與支出失衡。要將ADSC應用于臨床治療，ADSC應該符合以下四個條件：①可以于異體安全及有效地使用，減低患者負擔；②遵從國際認可規(guī)程分離、提取、擴增ADSC使質(zhì)量得到控制和保證；③大規(guī)模體外生產(chǎn)制造ADSC的實踐指南降低成本；④允許調(diào)控ADSC分化的方向及進程并重復培養(yǎng)結果。