以同源異形盒家族HOXC6基因?yàn)榘袠?biāo)熒光PCR鑒定地溝油的方法研究

楊冬燕 楊永存 李浩 耿藝介 張倩 吳雙 鄧平建

【摘 要】目的：以動(dòng)物源性的同源異形盒家族HOXC6基因?yàn)榘袠?biāo)建立地溝油鑒定方法。方法：通過基因數(shù)據(jù)庫的篩查、比對(duì)及特異性驗(yàn)證，篩選確定以動(dòng)物源性的同源異形盒家族HOXC6基因?yàn)榘袠?biāo)，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)正常植物油和地溝油進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：6個(gè)已知來源的地溝油樣品全部被鑒定為地溝油，而8個(gè)正常食用植物油全部被鑒定為非地溝油。 結(jié)論：與課題組前期建立的采用針對(duì)多個(gè)動(dòng)物物種特異性基因的PCR鑒定方法相比，該研究建立的方法在有效提高檢測靈敏度的同時(shí)，不但避免了先后擴(kuò)增多個(gè)基因片段的繁瑣，同時(shí)降低了PCR污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【關(guān)鍵詞】地溝油；同源異形盒家族；HOXC6基因；熒光PCR

地溝油也稱泔水油或潲水油，是不法商販將收集來的潲水，經(jīng)過水油分離、過濾、去味等程序處理后，重新得到的油脂。由于潲水中常常會(huì)混有污水、洗滌劑和其他各種雜質(zhì)，運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程也不會(huì)考慮任何衛(wèi)生要求，極易發(fā)酵變餿。加之地下作坊提煉過程純粹是以

“賣相”為目標(biāo)，根本無法除去細(xì)菌和有害化學(xué)成分，人食用后易引發(fā)頭昏、頭痛、惡心、嘔吐、腹部疼痛以及腸胃道疾病[1-2]。公眾強(qiáng)烈呼吁嚴(yán)厲打擊地溝油制售，有效遏制地溝油回流餐桌。

自2011年10月起，經(jīng)過全國范圍的征集、專家論證及盲樣考核， 初步確定7個(gè)地溝油檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證完善，但到目前為止尚未明確這些地溝油檢測方法的最終驗(yàn)證結(jié)果。課題組前期采用PCR技術(shù)，研究建立以雞、牛、豬、羊等各動(dòng)物物種特異性基因?yàn)榘袠?biāo)的地溝油鑒定方法，經(jīng)大量試驗(yàn)驗(yàn)證及專家評(píng)估表明，該方法與其他以差異性指標(biāo)為靶標(biāo)的檢測方法相比，其檢測指標(biāo)的高度特異性具有顯著優(yōu)勢(shì)，由于動(dòng)物源性基因是只存在于地溝油，不存在于正常食用植物油的特異性標(biāo)志物，只要從植物油樣中檢出動(dòng)物源性基因，不論其含量多寡，都可以判定該油樣為地溝油[3]。但前期方法的主要不足在于方法的靈敏度不足，且采用PCR技術(shù)擴(kuò)增多個(gè)基因片段，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，容易污染從而出現(xiàn)假陽性。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用靈敏度更高的熒光PCR技術(shù)，以動(dòng)物源性的同源異形盒家族HOXC6基因?yàn)榘袠?biāo)建立地溝油鑒定方法。該方法在有效提高檢測靈敏度的同時(shí)，不但避免了先后擴(kuò)增多個(gè)基因片段的繁瑣，同時(shí)降低了PCR污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器

熒光PCR擴(kuò)增采用TAKARA熒光PCR擴(kuò)增試劑盒（貨號(hào)DRR390）；引物、探針由大連寶生物技術(shù)公司合成。核酸蛋白分析儀（Eppendorf 6131）購自德國，ABI7500 熒光PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 樣品

1.2.1 地溝油樣品 DG01， DG02號(hào)地溝油樣來自食品監(jiān)督部門沒收，DG03～DG04地溝油樣由深圳市滕浪再生資源發(fā)展有限公司提供，DG05～DG06號(hào)是按照油脂精煉工藝精煉的地溝油樣品。

1.2.2 食用植物油樣品 樣品編號(hào)ZC01-ZC08， 分別為金龍魚第二代食用調(diào)和油、鴻禧牌壓榨一級(jí)花生油、刀嘜橄欖芥花籽油、金浩茶籽花生食用調(diào)和油、刀嘜玉米亞麻籽油、潤之家一級(jí)大豆油、福臨門一級(jí)大豆油、刀嘜葵花籽油，均購自深圳市萬佳超市。

1.2.3 動(dòng)物與植物樣品 選取7種動(dòng)物和11種植物組織樣品驗(yàn)證選取的靶標(biāo)基因的物種特異性，動(dòng)物物種包括牛、羊、豬、馬、雞、鴨、魚；植物樣品包括芝麻、葵花籽、油菜籽、花生、油棕、棉籽、玉米、大豆、小麥、大米、辣椒。

1.2.4質(zhì)控樣品：PCR擴(kuò)增陽性對(duì)照樣品為源自豬肉的核酸提取物；以去離子滅菌水作為PCR空白對(duì)照。

1.3. 核酸提取

1.3.1 地溝油核酸提?。旱販嫌秃怂崽崛〔捎谜n題組之前建立的精煉食用植物油DNA提取方法[3-4]。

1.3.2 食用植物油核酸提?。悍椒ㄍ?.3.1地溝油核酸提取。

1.3.3 驗(yàn)證樣品核酸提取：

1.3.3.1 動(dòng)物組織基因組DNA的錯(cuò)誤！鏈接無效。 采用網(wǎng)絡(luò)檢索到的方法[5]，略加改動(dòng)， 將樣品量及所有試劑用量減少到1/10。

1.3.3.2 植物組織基因DNA的錯(cuò)誤！鏈接無效。 植物組織經(jīng)磨機(jī)磨成粉末后取100mg，利用Qiagen Mini Plant DNA extraction kit 試劑盒，按照試劑盒操作說明錯(cuò)誤！鏈接無效。基因組DNA。

1. 4樣品核酸提取效果評(píng)估 對(duì)上述各種樣品按相應(yīng)的方法提取核酸后，采用核酸蛋白分析儀測定核酸提取液的DNA含量，從而確定核酸提取效果。

1.5靶標(biāo)基因的篩選與確定 根據(jù)課題需要查閱了大量文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)出了人、大鼠、小鼠中共有的基因條目約500條，之后，以這500條基因序列信息為對(duì)象，在深圳華大基因公司的千種植物基因組數(shù)據(jù)庫中做比對(duì)，篩選出一批植物中沒有的基因；其后，將篩選出的基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中做BLAST比對(duì)，最終確定在國人飲食涉及的常見動(dòng)物中的普遍存在的靶標(biāo)基因——同源異形盒家族HOXC6基因，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，引物探針由大連寶生物公司合成。

1.6 熒光PCR檢測 擴(kuò)增反應(yīng)體系參照試劑盒說明，在20μL熒光PCR擴(kuò)增體系中，引物濃度0.4μmol/L， 模板含量為40pg擴(kuò)增。熒光PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30s、95℃變性5s、60℃退火與延伸30s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行一次平行測定。

2 結(jié)果

2.1 樣品核酸提取結(jié)果

對(duì)上述各種樣品按相應(yīng)的方法提取核酸后，采用核酸蛋白分析儀測定核酸提取液的DNA含量，結(jié)果表明動(dòng)物組織核酸提取得率最高，核酸提取液的DNA濃度高達(dá)100-140?g/ml， 植物樣品核酸提取液的DNA濃度在50-65?g/ml， 食用植物油和地溝油由于在精煉加工過程中對(duì)核酸的破壞和降解，導(dǎo)致核酸提取液中DNA濃度較低，只有6-13?g/ml， 但該濃度尚能滿足熒光PCR擴(kuò)增的需要。

2.2 靶標(biāo)基因及目標(biāo)擴(kuò)增片段的篩選結(jié)果

按照上述篩選方法，通過與深圳華大基因公司的千種植物基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，本研究確定HOXC6基因（Genbank NW 153693）639-904bp之間的片段與千種植物基因不相匹配，并根據(jù)此段基因采用Primer 5軟件 設(shè)計(jì)引物和探針，最終確定上游引物為5-CTCGACTCCCTTTTATTC-3，下游引物為5-CTGTGTGTTATGTCCTAAG -3，探針5 AATGTCGTGTTCAGTTCCAGCC 3，報(bào)告基團(tuán)FAM490，淬滅基團(tuán)Eclipse，擴(kuò)增142bp的目標(biāo)片段，如圖1所示。

圖1 HOXC6基因639-904bp段及目標(biāo)擴(kuò)增片段

2.3 目標(biāo)擴(kuò)增片段特異性驗(yàn)證

本研究選取牛、羊、豬、馬、雞、鴨、魚7種動(dòng)物的肌肉組織和芝麻、葵花籽、油菜籽、花生、油棕、棉籽、玉米、大豆、小麥、大米、辣椒11種植物組織，提取基因組DNA，熒光PCR擴(kuò)增HOXC6基因目標(biāo)片段。擴(kuò)增結(jié)果顯示哺乳動(dòng)物樣品Ct值小于21，雞、鴨、魚等非哺乳動(dòng)物擴(kuò)增陰性或Ct值較大；而11種植物組織的HOXC6基因目標(biāo)片段的擴(kuò)增結(jié)果全部為陰性（見表1），實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線見圖2和圖3。

2.4 地溝油和食用植物油鑒定結(jié)果

針對(duì)DG01-DG06號(hào)地溝油樣品和ZC01-ZC08食用植物油樣品的HOXC6基因目標(biāo)片段擴(kuò)增結(jié)果顯示6個(gè)地溝油樣品全部檢出目標(biāo)核酸片段，而正常植物油樣品擴(kuò)增結(jié)果全部為陰性（見表2），實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線見圖4和圖5。

3 討論

同源異型盒基因（homeobox genes，Hox）是動(dòng)物同源異形基因中的保守基因片段，是調(diào)控動(dòng)物個(gè)體的體節(jié)、椎骨位置及其形態(tài)和數(shù)量的基因。其在胚胎發(fā)育中的表達(dá)水平對(duì)于組織和器官的形成具有重要的調(diào)控作用，該類基因的突變會(huì)在胚胎發(fā)育過程中導(dǎo)致某一器官異位生長。哺乳動(dòng)物具有四個(gè)相似的HOX基因簇，分別是HOXA、HOXB、HOXC和HOXD，它們位于不同的染色體上，由9到11個(gè)基因串聯(lián)而成[6，7]。HOXC基因位于人12號(hào)染色體，HOXC6是其中一個(gè)子類基因。哺乳動(dòng)物的HOXC4、HOXC5 和HOXC6共用一段非編碼外顯子，對(duì)于每一個(gè)基因來說，其轉(zhuǎn)錄子可能包括這段共用序列和它特異的外顯子序列，也可能只包括特異的外顯子序列。本研究針對(duì)哺乳動(dòng)物組織的HOXC6基因擴(kuò)增結(jié)果全部為強(qiáng)陽性，其Ct值均小于21，對(duì)雞、鴨、魚3種非哺乳動(dòng)物的擴(kuò)增結(jié)果顯示鴨肉組織擴(kuò)增陰性，雞肉組織擴(kuò)增Ct值為22.37，魚肉組織擴(kuò)增Ct值為31.68，結(jié)果提示本研究選定的HOXC6基因擴(kuò)增片段在哺乳動(dòng)物中具有嚴(yán)格的保守性，但HOXC6基因不是哺乳動(dòng)物特異性的序列，與其他非哺乳動(dòng)物存在一定的交叉。而該基因片段與千種植物基因比對(duì)未檢出同源序列，且本研究針對(duì)11種植物組織的擴(kuò)增結(jié)果全部為陰性，因此，HOXC6基因的動(dòng)物特異性屬性完全滿足地溝油檢測的需要。

本研究通過HOXC6基因擴(kuò)增方法對(duì)3個(gè)不同來源的6個(gè)已知地溝油樣品進(jìn)行鑒定檢測，結(jié)果顯示6個(gè)樣品檢測結(jié)果全部為陽性，由于6個(gè)地溝油樣品精煉程度不同，其擴(kuò)增Ct值也有一定差異，DG03和DG04號(hào)油樣精煉程度最低，擴(kuò)增Ct值最小，提示其內(nèi)目標(biāo)核酸片段濃度最高，而隨著精煉程度的提高，地溝油中核酸殘留漸少，對(duì)擴(kuò)增靈敏度要求更高。該研究所用的6個(gè)樣品，同時(shí)采用課題組前期建立的以雞、牛、豬、羊等各動(dòng)物物種特異性基因?yàn)榘袠?biāo)的普通PCR鑒定方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示5個(gè)檢出地溝油陽性，其中DG05號(hào)樣品為陰性，而該樣品采用本研究檢測結(jié)果Ct值最大，提示采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法以HOXC6基因?yàn)榘袠?biāo)鑒定地溝油，其檢測靈敏度略高于普通PCR方法，且只需擴(kuò)增一個(gè)靶標(biāo)片段，方法更簡便，結(jié)果更可靠。

致謝：

本研究在靶標(biāo)基因篩選及與植物基因數(shù)據(jù)庫比對(duì)工作中獲得深圳華大基因公司的大力支持，特此致謝。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡介：

楊冬燕（1972-），女，碩士，主任技師，主要從事食品衛(wèi)生檢驗(yàn)和研究工作

通訊作者：

鄧平建，男，主任技師

基金項(xiàng)目：

1. 深圳市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 深衛(wèi)人醫(yī)政【2012】251號(hào)；2. 深圳市技術(shù)研究開發(fā)計(jì)劃技術(shù)攻 關(guān)項(xiàng)目（深發(fā)改【2012】866號(hào)）