索拉非尼聯(lián)合希羅達(dá)對肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

王亮 趙家泉

【摘 要】目的：檢測索拉非尼單藥、希羅達(dá)單藥以及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞株P(guān)LC以及肝癌移植瘤動物模型的生長抑制作用，探討兩藥聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同抗腫瘤機(jī)制。方法：設(shè)不同濃度的索拉非尼和不同濃度的希羅達(dá)單藥組，及索拉非尼+希羅達(dá)聯(lián)合用藥組，以不加藥組作為對照組，分別觀察其對肝癌細(xì)胞株P(guān)LC的生長抑制作用。MTT法檢測索拉非尼、希羅達(dá)單藥及聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞株P(guān)LC的增殖抑制作用。BALB/C裸鼠皮下接種肝癌PLC細(xì)胞建立肝癌移植瘤動物模型，隨機(jī)分成索拉非尼、希羅達(dá)單藥組和索拉非尼+希羅達(dá)聯(lián)合用藥組，另設(shè)以不加藥組作為對照組，觀察各組腫瘤生長情況，免疫組織化學(xué)法檢測各組移植瘤組織內(nèi)的VEGF表達(dá)情況。結(jié)果：索拉非尼、希羅達(dá)單藥與聯(lián)合應(yīng)用均能抑制PLC細(xì)胞增殖，呈劑量-時間依賴效應(yīng)，聯(lián)合組的抑制作用更強(qiáng)（P<0.05），兩藥聯(lián)用有協(xié)同效應(yīng)。與對照組比較，索拉非尼、希羅達(dá)單藥組及聯(lián)合用藥組的腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均顯著減少，P<0.05；聯(lián)合應(yīng)用組的腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量較索拉非尼及希羅達(dá)單藥組顯著減少，P<0.05。與對照組相比，索拉非尼、希羅達(dá)單藥組和聯(lián)合用藥組VEGF表達(dá)明顯減少，P 值分別為0.018、0.029和0.013；與索拉非尼、希羅達(dá)單藥組相比， 聯(lián)合用藥組VEGF的表達(dá)下降更明顯，P 值分別為0.046 和0.036。結(jié)論：索拉非尼及希羅達(dá)對肝癌細(xì)胞株P(guān)LC均有抑制增殖作用，聯(lián)合抑制作用更強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)索拉非尼和希羅達(dá)可抑制裸鼠肝癌細(xì)胞移植瘤的生長，兩藥聯(lián)合的效應(yīng)更明顯，可協(xié)同降低VEGF的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】索拉非尼；希羅達(dá)；肝癌

肝細(xì)胞性肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，我國是世界上肝癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)生率約為30.3/10萬[1]，目前手術(shù)切除仍是治療肝細(xì)胞性肝癌的首選方法。但是大多數(shù)患者在就診時己是晚期，而那些行肝癌根治性切除后病人的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)61.5%，小肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率為43.5%[2]，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)成為目前肝癌臨床治療的難題。因此，尋找一種有效的非手術(shù)治療方法來治療或輔助治療肝細(xì)胞性肝癌具有重要意義。近年來，分子靶向藥物治療肝細(xì)胞性肝癌已成為新的研究熱點(diǎn)， 受到高度的關(guān)注。索拉非尼是一種雙芳基尿素類口服多激酶抑制劑，它具有雙重抗腫瘤作用[3][4]。希羅達(dá)則是一種新型的選擇性口服化療藥物，通過三步酶鏈反應(yīng)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化為5-FU，繼而殺死腫瘤細(xì)胞。本研究探討索拉非尼聯(lián)合希羅達(dá)，對人肝癌PLC細(xì)胞和肝癌移植瘤的抑制作用，證實(shí)兩藥聯(lián)合可以具有協(xié)同作用，為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)與臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC， 購自中科院上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)傳代于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中， 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物及試劑索拉非尼，由拜耳公司生產(chǎn)，應(yīng)用100%DMSO溶解，于-20°保存，實(shí)驗(yàn)用時稀釋，DMSO終濃度<0.5%。希羅達(dá)由上海羅氏有限公司生產(chǎn)；DMEM﹑胎牛血清﹑胰酶由南京都英科技有限公司購買；MTT及DMSO由Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物： BALB/Cnu/nu雌性裸小鼠由南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，鼠齡4-5周，體重17-20克，由鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心負(fù)責(zé)裸鼠室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 MTT法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制

培養(yǎng)PLC細(xì)胞，取對數(shù)生長期PLC細(xì)胞，以5*103/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h后加入藥物。實(shí)驗(yàn)分組：索拉非尼（1.5 ，3，6umol/L）和希羅達(dá)（6，12，24umol/L）分別組成單藥組和索拉非尼+希羅達(dá)聯(lián)合用藥組，另設(shè)不加藥的對照組，作用于PLC細(xì)胞。每個劑量設(shè)5個復(fù)孔，加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后每孔加入MTT（5mg/m1）10uL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加150 ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解，用酶標(biāo)儀（波長570nm）測定各孔的OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率（%）=（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×l00%。采用協(xié)同作用q 值判斷索拉非尼和希羅達(dá)聯(lián)用的性質(zhì)。q值的計算公式為：q=EAB/（EA+EB-EA×EB）。式中EA和EB為各藥單用抑制率， EAB為兩藥合用抑制率。q>1.15為協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15為相加作用，q<0.85為拮抗作用。

1.3 建立荷人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型

培養(yǎng)人肝癌PLC細(xì)胞至對數(shù)生長期時，接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下血供豐富的部位，注射腫瘤細(xì)胞懸液 （0.2ml/只），含活細(xì)胞107/0.2ml。

1.4 荷瘤裸鼠分組體內(nèi)試驗(yàn)

將已成瘤的荷PLC移植瘤的裸鼠根據(jù)移植瘤的瘤積均衡選出40只，隨機(jī)分成4組：

空白對照組：0.9%生理鹽水胃管灌入0.2ml，每天一次，（第1-21天）。

索拉非尼單藥組：0.9%生理鹽水胃管灌入0.1ml，每天一次+索拉非尼40mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，qd（1-21天）。

希羅達(dá)單藥組：0.9%生理鹽水胃管灌入0.1ml，每天一次+希羅達(dá)180mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，qd（1-21天）。

索拉非尼聯(lián)合希羅達(dá)組：索拉非尼40mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次+希羅達(dá)180mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，qd（1-21天）。分別計算各組給藥前1天和給藥后第22天的腫瘤體積。

計算公式腫瘤體積長徑×短徑×短徑/2。

1.5 裸鼠皮下移植瘤模型的標(biāo)本采集及檢測

實(shí)驗(yàn)的第22天，頸椎脫位處死裸鼠，把皮下移植瘤連同胞膜完整剝離出腫瘤組織，電子天平稱取瘤重。收集腫瘤酒精固定，石蠟包埋，拼厚連續(xù)切片。腫瘤組織HE染色，免疫組織化學(xué)法檢測各組移植瘤組織的VEGF的表達(dá)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 索拉非尼和希羅達(dá)對PLC細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果顯示，索拉非尼或希羅達(dá)處理24、48、72h后，對PLC細(xì)胞生長均有一定抑制作用，表現(xiàn)為時間-劑量依賴效應(yīng)。而兩藥聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞抑制率明顯增加，分別為單藥組的1.56～4.13倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。用factorial analysis分析兩藥聯(lián)用的性質(zhì)，結(jié)果顯示為兩藥聯(lián)用具有交互效應(yīng)（P<0.05），且為協(xié)同作用。

2.2 在給藥的第17﹑18天索拉非尼組和希羅達(dá)組各有l(wèi)只死亡，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)系插胃管時誤入氣管所致。改正操作失誤后未再有動物死亡。實(shí)驗(yàn)過程中各組裸鼠未見明顯不良反應(yīng)，飲食正常。

2.2.1各組給藥前后皮下移植瘤的瘤積和瘤重結(jié)果

各組裸鼠的瘤積在給藥前無顯著性差異（P=0.275），用藥后的各組瘤積和瘤重較對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合組的瘤積和瘤重較單藥索拉非尼組及希羅達(dá)組均顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

對照組細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒沉著，細(xì)胞染色多為陽性或強(qiáng)陽性，索拉非尼組、希羅達(dá)組及聯(lián)合組沉著很少，細(xì)胞染色多為弱陽性。與對照組相比，索拉非尼、希羅達(dá)單藥組和聯(lián)合組VEGF表達(dá)明顯減少， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P 值分別為0.1018、0.1029和0.1013。與索拉非尼和希羅達(dá)單藥組相比，聯(lián)合組VEGF的表達(dá)下降更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P 值分別為0.1046和0.1036。

3 討論

索拉非尼是一種雙芳基尿素類口服多激酶抑制劑，它具有雙重抗腫瘤作用[3][4]。一方面通過抑制RAS / RAF / MEK / ERK信號傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長，另一方面通過抑制幾種與新生血管生成和腫瘤發(fā)展有關(guān)的酪氨酸激酶受體的活性，包括血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2），VEGFR-3，血小板衍生的生長因子受體-β（PDGFR-β）和c-KIT原癌基因，阻斷腫瘤新生血管生成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而起到抗腫瘤作用。

希羅達(dá)（Xeloda）是新型的選擇性口服化療藥物，通過三步酶鏈反應(yīng)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化為5-FU，繼而殺死腫瘤細(xì)胞[5]。由于希羅達(dá)只被腫瘤組織內(nèi)特有的TP酶激活而轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)，故對正常組織和細(xì)胞作用很小。細(xì)胞學(xué)部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用索拉非尼與希羅達(dá)對PLC細(xì)胞均有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，而且聯(lián)合應(yīng)用后提高了腫瘤細(xì)胞的抑制率和凋亡比例。肝細(xì)胞性肝癌是血管豐富的實(shí)體腫瘤， VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生長因子，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有重要意義[6]。在本研究中發(fā)現(xiàn)索拉非尼治療組VEGF的表達(dá)也顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。推測其對VEGF的抑制作用與MAPK通路的阻斷有關(guān)。將索拉非尼和希羅達(dá)聯(lián)合作用于肝癌裸鼠移植瘤模型，顯示聯(lián)合用藥組VEGF 的表達(dá)也顯著降低（P < 0.05）。抑瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也充分肯定了索拉非尼和希羅達(dá)對肝細(xì)胞性肝癌裸鼠移植瘤的生長抑制有協(xié)同作用。與索拉非尼單藥和希羅達(dá)單藥相比，兩藥聯(lián)合能明顯降低移植瘤的瘤體積和瘤質(zhì)量（P < 0.05）。除了兩者對腫瘤血管生成的聯(lián)合阻斷作用外，也有聯(lián)合抑制腫瘤增殖的作用。

4 結(jié)論

4.1索拉非尼及希羅達(dá)對PLC肝癌細(xì)胞株均有抑制增殖作用，聯(lián)合抑制作用更強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)索拉非尼和希羅達(dá)可抑制裸鼠PLC肝癌細(xì)胞移植瘤的生長，兩藥聯(lián)合的效應(yīng)更明顯，可協(xié)同降低VEGF的表達(dá)。

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