花生CEM1基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

張廷婷等

摘要：通過規(guī)模測序和生物信息學(xué)分析，從花生莢果不同發(fā)育時期全長cDNA文庫中篩選出MADS-box家族的一個cDNA全長序列，命名為CEM1基因（GenBank登錄號為EY396043）。該基因全長1 061 bp，包含762 bp的開放閱讀框，編碼253個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為29405 ku，等電點（pI）為918。蛋白質(zhì)信號肽分析和疏水性分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)信號肽剪切的可能性很小，具有親水性。同時構(gòu)建CEM1基因的VIGS表達(dá)載體，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；莢果發(fā)育；CEM1基因；生物信息學(xué)；載體構(gòu)建

中圖分類號：Q785：S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）08-0009-06

MADS-box的名稱來自釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子MCM1、擬南芥花同源異型基因蛋白AGAMOUS、金魚草花同源異型基因蛋白DEFICIENS和人血清應(yīng)答因子SRF 4種蛋白的首字母，這4種蛋白質(zhì)都有一個由56～58個氨基酸組成的高度保守的MADS盒，編碼含有這種保守序列蛋白因子的基因稱為MADS-box基因。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可以引起內(nèi)源mRNA序列特異性降解_[1，2]，即如果在病毒載體中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物會表現(xiàn)出目的基因功能喪失或者表達(dá)水平下降的表型，從而確定基因功能。其作用機制為：含有目的基因片段的病毒載體在被侵染的植物組織中大量復(fù)制，病毒載體中的目的片段在RNA引導(dǎo)的RNA聚合酶作用下合成大量的雙鏈RNA（Double-stranded RNA， dsRNA）；dsRNA在Dicer酶的作用下產(chǎn)生21～25個核苷酸的短干擾RNA（Small interfering RNA， siRNA）；然后，siRNA的反義鏈和RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex， RISC）結(jié)合，特異性識別細(xì)胞質(zhì)中目的基因的單鏈mRNA，造成目的基因mRNA的特異性降解，從而導(dǎo)致目的基因在RNA水平上的沉默_[3～5]。本試驗克隆了花生MADS-box基因，對其及編碼的蛋白進行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了VIGS表達(dá)載體，為轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)，這對花生分子育種實踐以及闡明果實與種子發(fā)育相關(guān)的遺傳和生理現(xiàn)象具有重要意義。

1材料與方法11試驗材料

1.1.1植物材料本研究所用材料為花生品種閩花6號。

1.1.2試劑與儀器本研究所用逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、Ex Taq酶 、RNA酶抑制劑、內(nèi)切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等購自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒購自北京博大泰克公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

Biometra PCR儀購自華粵行儀器有限公司；UV-2800/2802/2802S型紫外可見分光光度計購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；UV-2000系列紫外分析儀購自天能科技（上海）有限公司。

2結(jié)果與分析

2.1花生CEM1基因的克隆

通過全長cDNA文庫篩選和EST測序得到了該基因的EST序列，其克隆號為2P7，命名為CEM1， GenBank登錄號為EY396043。雙向測序結(jié)果表明CEM1全長1 061 bp，包含一個762 bp的ORF，編碼253個氨基酸（圖1），相對分子量為29405 ku，理論等電點（pI）為918。將該基因序列在NCBI中進行Blast比較，結(jié)果與豌豆已知基因（GenBank 登陸號為AAX69070）的同源性為79%；將推導(dǎo)的氨基酸序列在蛋白數(shù)據(jù)庫里進行Blast分析，結(jié)果與一個花生MADS-box基因氨基酸序列同源性為84%，由此確認(rèn)CEM1是花生MADS-box基因。

2.2CEM1蛋白序列分析

將推導(dǎo)的CEM1氨基酸序列與其它10個物種來源的MADS-box氨基酸序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。序列比對結(jié)果顯示CEM1與大豆的AGL1（GI：358248235）序列比較一致，與苜蓿等其它來源的氨基酸序列也存在一定的同源性（圖2）。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示CEM1與大豆AGL1親緣關(guān)系較近（圖3）。

2.3CEM1蛋白的結(jié)構(gòu)域、信號肽與疏水性分析

將推導(dǎo)的CEM1氨基酸序列進行保守區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)該序列有兩個保守結(jié)構(gòu)域：MADS_MEF2_like功能域和K-box結(jié)構(gòu)域（圖4）。具有MADS-box蛋白的典型結(jié)構(gòu)。

3討論

MADS-box是一類數(shù)量龐大的基因家族，其編碼的蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的MADS-box 結(jié)構(gòu)域和半保守的能形成卷曲螺旋的K區(qū)_[6]。MADS-box基因又分為3個主要類群，即ARG80基因家族、MEF2基因家族以及MIKC基因家族_[7]。植物基因組含有大量的MADS-box基因，它在植物的發(fā)育過程尤其是生殖發(fā)育過程中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用_[8]，其主要功能是調(diào)控植物花的發(fā)育和果實的成熟。但也有研究顯示MADS-box調(diào)控著其它器官的發(fā)育，如Buchner等發(fā)現(xiàn)一個MADS-box基因在豌豆種皮中表達(dá)_[9]。關(guān)于花生MADS-box基因及其對胚胎和種子發(fā)育過程調(diào)節(jié)作用的研究還未見報道。本研究克隆得到花生CEM1基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析，確認(rèn)為花生MADS-box家族的一員，并構(gòu)建了VIGS表達(dá)載體，對于利用遺傳操作技術(shù)如轉(zhuǎn)基因等培育優(yōu)良的作物品種_{[10，11，12]}、解釋植物生長發(fā)育理論和闡明相關(guān)的遺傳和生理現(xiàn)象等具有重要意義。

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