豬鏈球菌的分離與鑒定

莊曉薇

摘要：對16份豬場病豬病料進行病原菌分離、血清學鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗，結果表明，該病原菌為II 型豬鏈球菌，引起關節(jié)炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。

關鍵詞：豬鏈球菌；分離；鑒定

中圖分類號：S852.61+1 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）08-0013-03

豬鏈球菌 （Streptococcosis suis） 是引起豬的多種疾病的病原菌之一，該病原菌在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家如美、英、荷蘭及愛爾蘭等國常有發(fā)生。我國于 1958 年就有豬鏈球菌病的報道，1976 年我國南方幾省曾一度廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大危害[1]。

目前發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌莢膜型已超過 30 種。該病一年四季均可發(fā)生，但以 4～10 月份發(fā)生較多。常為地方性流行，多呈敗血性，短期波及全群，如不進行防治，則發(fā)病率、病死率很高，慢性常為地方性散發(fā)性傳染[2]。

1 豬場發(fā)病情況

2012 年 4 月，山東省臨朐縣某生豬繁育場仔豬流行關節(jié)炎及敗血癥，發(fā)病豬多為 2～6 周齡仔豬。無菌采取病豬的關節(jié)液、肝、脾、肺及腸系膜淋巴結，經(jīng)實驗室分離鑒定，證實為II 型豬鏈球菌。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 病料 無菌采取該生豬繁育場患關節(jié)炎病豬的關節(jié)液 8 份，分別編號為 1-8 號；無菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結 8 份，分別編號為 9～16 號。

2.1.2 試劑 試驗所用的各種糖均購自上?；瘜W試劑二廠，批號為 2010～2012 年不等。

2.1.3 培養(yǎng)基 綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10 ml/L豬血清肉湯及各種糖培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備。

2.1.4 試驗抗原 豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購自中國獸藥鑒察所，批號為 990725。

2.1.5 藥敏紙片 購自廣東省某軍區(qū)后勤部，批號 20000312。

2.1.6 試驗動物 健康小白鼠 （30～35 g） 50 只，購自青島農業(yè)大學動物科技學院。

2.2 方法

2.2.1 病原分離 將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后分別接種于鮮血瓊脂平板。37 ℃ 需氧培養(yǎng) 24 h 后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種于血清肉湯，純化后放置 4 ℃，冷藏備用[3]。

2.2.2 分離菌株的鑒定

（1）生化試驗。隨機抽取上述分離菌血清肉湯培養(yǎng)物 3#、8#、13#、15#，分別接種于蔗糖、山梨醇、棉子糖、葡萄糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察其對糖的利用情況[4]。

（2）血清學鑒定。將 3#、8#、13#、15# 菌經(jīng)血清肉湯培養(yǎng) 8 h，通過 3 000 r/min 離心 10 min，PBS 洗滌 2 次，用pH 7.2 的 0.01mol/L PBS制成 1：10～1：20倍稀釋的細菌懸液。取 1 滴上述細菌懸液與適當?shù)目寡逶跐崈舨Ｆ匣靹?，立即觀察凝集現(xiàn)象。同時，設立細菌懸液對照及血清對照[5]。

2.2.3 致病力及保護力試驗

（1）菌落形成單位的測定。①將已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別倒入已滅菌過的培養(yǎng)皿內，每皿約 15 mL 培養(yǎng)基，啟開皿蓋暴露于無菌室內的不同地方，10 min 后，蓋好皿蓋。② 將培養(yǎng)皿倒置于 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后，觀察菌落情況，統(tǒng)計菌落數(shù)。③如果每個皿內菌落不超過 4 個，則可以認為無菌程度良好，菌落數(shù)很多，則應對無菌室進一步滅菌，再重復以上步驟。

（2）致病力試驗。無菌吸取上述血清肉湯培養(yǎng)物（含菌量5.0×108 CFU/mL） 以0.1、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 mL/只分別腹腔注射小白鼠，觀察其死亡時間和數(shù)量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養(yǎng)物腹腔注射小白鼠，小白鼠共 14 只，分 7 組。第一組每只小白鼠注射 3# 菌 0.2 mL，第二組每只注射 8# 菌0.2 mL，第三組每只注射 3#、8# 菌各0.1 mL，第四組每只注射 13# 菌 0.2 mL，第五組每只注射 15# 菌 0.2 mL，第六組每只注射13#、15# 菌各 0.1 mL，第七組每只注射無菌血清肉湯 1.0 mL作對照。以上各組分別飼養(yǎng)觀察其死亡時間及數(shù)量[6]。

（3）保護力試驗。將3#、8#、13#、15# 血清肉湯培養(yǎng)物分別接種于 18 cm 鮮血平板。37 °C 培養(yǎng) 24 h 后收菌。再用麥氏比濁管比濁，適當稀釋，然后用 0.3% 甲醛滅活，37 ℃ 作用 24 h后做無菌檢驗。然后將其分別腹部皮下接種小白鼠各 2 只，劑量為 0.4 mL/只。10 d后，再分別進行人工感染，劑量為 0.2 ml/只[7]。

（4）細菌回收試驗。對致病力試驗出現(xiàn)癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進行分離。

2.2.4 藥敏試驗 采用紙片擴散法，用無菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于 9 cm 鮮血平板；待稍微干燥后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，4 ℃ 2 h使藥物擴散，然后置 37 ℃培養(yǎng) 20～24 h，觀察結果。結果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標準，評定為高度敏感、中度敏感或耐藥[8]。

3 結果與分析

3.1 分離細菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

3.1.1 培養(yǎng)特性 37 ℃培養(yǎng) 24 h 后，所采集的12 份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的 β 溶血環(huán)。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3.1.2 染色特性 關節(jié)液、鮮血瓊脂血清肉湯培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽性，在關節(jié)液、鮮血瓊脂培養(yǎng)物中多呈單個、雙球或短鏈狀排列。

3.2 生化試驗結果

表1結果表明分離的3#、8#、13#、15# 菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。

3.3 血清學鑒定結果

將 3#、8#、13#、15# 細菌懸液與 1/2 及 II 型抗血清混合，立即可見明顯的凝集現(xiàn)象，但不與 1 型及其他型抗血清出現(xiàn)凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。陰性對照均未見凝集現(xiàn)象。

3.4 致病力及保護力試驗結果

3.4.1 致病力試驗結果 第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養(yǎng)物 48 h 內均未見死亡，第三組 48 h 內有一只死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養(yǎng)物 18 h 內全部死亡。死亡后，小白鼠皮膚發(fā)紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血癥。第七組健活。由于第一、二、三組小白鼠死亡數(shù)量較少，所以再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各 2 只，48 h 后處死，剖檢發(fā)現(xiàn)注射部位有直徑 0.9～1.1 cm 的膿腫，濃汁呈黃綠色。

3.4.2 保護力試驗結果 免疫的小白鼠再經(jīng)攻毒后均未發(fā)病。

3.5 細菌回收試驗結果

將上述死亡及發(fā)病的小白鼠剖檢采集病料，進行細菌分離、生化試驗及血清學鑒定，能得到原分離菌。

3.6 藥敏試驗結果

由表2可知，分離菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感；潔霉素和卡那霉素中度敏感；而對土霉素、鏈霉素、慶大霉素具有耐藥性。

4 討論

過去屢有敗血型豬鏈球菌的報道，而關于集約化養(yǎng)豬場關節(jié)炎型鏈球菌病的報道較少。本次試驗從患關節(jié)炎豬的關節(jié)液中成功分離出了豬鏈球菌。另外，該種豬場約有60% 的仔豬流行關節(jié)炎，嚴重者可發(fā)生敗血癥而死亡，給種豬場造成巨大的經(jīng)濟損失。所以，研究該病可為生產中防制該病提供理論依據(jù)。

病豬的鼻液、尿液、肌肉、內臟和關節(jié)內均帶有病原體，建議首先應加強對健康豬的免疫。另一方面，在發(fā)病后對病豬和健康豬進行隔離，根據(jù)實驗室藥敏試驗結果配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。該種豬繁育場采納我們的建議，首先對所有的未發(fā)病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對已發(fā)病的豬用青霉素等藥物配合治療，另外注意衛(wèi)生管理。該病得到有效的控制。

5 結論

引起豬關節(jié)炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血癥的豬鏈球菌的致病力較強。但通過生化試驗和血清學鑒定，它們又是同種細菌且血清型也相同。同種血清型的豬鏈球菌的致病力之間的差異還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] 楊本升，劉玉斌，茍仕金，等. 動物微生物學[M]. 長春：吉林科學技術出版社，1995.

[2] 黃毓茂，黃引賢.2型豬鏈球菌的血清學鑒定[J].中國獸醫(yī)學報，1995，15（1）：63-65

[3] 李健強，李大金.獸醫(yī)微生物學實驗實習指導[M]. 西安：陜西科學技術出刊社，1999.

[4] 張彥明，賈靖國，劉安典.動物性食品衛(wèi)生檢驗技術[M]. 西安.西北大學出版社，1996.

[5] 蔡寶祥.家畜傳染病學[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，1998.

[6] 甘肅農業(yè)大學.獸醫(yī)微生物學[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，1982.

[7] 劉榮標.獸醫(yī)微生物學（上）[M]. 臺北：藝軒圖書出版社，1984.

[8] 鄭明球.家畜傳染病學實驗指導[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，1999.