RNAi介導Frizzled—9基因沉默對肝癌細胞株HepG—2增殖和轉(zhuǎn)移的影響

謝宏民　楊新魁　李佳璇??

【摘要】 背景與目的 肝癌（hepatic carcinoma）是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位。本研究將探索性地研究Frizzled-9在所有的肝細胞癌中都有表達，并且表達多少與肝癌的擴散及侵襲相關(guān)，而且，干擾了肝癌細胞FZ9后，通過Transwell小室模型檢測被剔除了FZ9基因HepG-2細胞移動能力，為探尋治療胰腺癌的新策略提供思路。方法 應(yīng)用RT-PCR方法檢測肝癌細胞株HepG-2的FZ9的表達情況。并應(yīng)用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染FZ9-siRNA至肝癌細胞株HepG-2。通過Transwell小室模型分析肝癌細胞的移動、侵襲性。結(jié)果 Frizzled-9特異的siRNA明顯抑制HepG-2細胞中FZ9及蛋白的表達，與對照組比較其抑制率為97.6%。轉(zhuǎn)染Frizzled-9-siRNA（5nM）24小時后對肝癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力有顯著影響（P〈0.05），實驗組較空白組轉(zhuǎn)移及侵襲能力減弱。

【關(guān)鍵詞】 Frizzled-9；RNA干擾（RNAi）；肝癌；細胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.063 文章編號：1004-7484（2013）-08-4170-01

1 實驗方法

1.1 細胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。待細胞進入對數(shù)生長期，即可用于下一步實驗。

1.1.1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞 采用Hiperfect Transfection Reagent介導的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。參閱其產(chǎn)品說明書進行轉(zhuǎn)染，實驗分4組：空白對照組：HepG-2常規(guī)培養(yǎng)，不予干預，陰性對照組：轉(zhuǎn)染通用對照shRNA（HK）或轉(zhuǎn)染帶有熒光標記的對照siRNA，以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效，陽性對照組：轉(zhuǎn)染GAPDH siRN，實驗組。轉(zhuǎn)染Frizzled-9 siRNA1）轉(zhuǎn)染前24小時接種HepG-2細胞于6孔板，使細胞在24小時后融合。37℃，5%CO2培養(yǎng)細胞24小時，取1.5ml EP管將150mgsiRNA（20uM siRNA 3.3ul）溶于85ul 1640/DMEM，加入Hiperfect Transfection Reagent 12ul，使總體積為100ul，顛倒混勻，室溫下放置10min，形成轉(zhuǎn)染復合物。使用37℃CPBS沖洗細胞兩遍，將轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)復合物加入相應(yīng)的孔后，混勻。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)細胞。24小時后棄去含轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基，用37℃CPBS沖洗細胞兩遍用于后續(xù)實驗。

1.2 trans-well轉(zhuǎn)移小室模型測定Frizzled-9對胰腺癌細胞侵襲能力的影響 用70%酒精處理無菌鑷子，用鑷子裝置好小室，小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1小時，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液，消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，下腔室中加入500ul含有20%FBS條件培養(yǎng)基，取上述細胞懸液300μl加入Transwell小室培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)24小時，棉頭拭子擦去基質(zhì)和上方的細胞，加入500ul細胞染液（試劑盒配帶）于24孔板中，將小室放入浸泡20min，將下表面的細胞染色，將小室放入蒸餾水中洗去其它染液，空氣晾干，顯微鏡下直接觀察穿過膜的細胞數(shù)，隨機計數(shù)10個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)穿過微孔的細胞數(shù)，以侵襲細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

2 實驗結(jié)果

Transwell侵襲小室模型測定細胞體外侵襲能力謝宏民根據(jù)前述細胞計數(shù)法，在普通顯微鏡下觀察細胞數(shù)，見圖1。

3 討 論

（Fz）是一種細胞表面受體，它可與介導細胞移動的Wnt配體相結(jié)合，有10個同源基因[1-2]，F(xiàn)z9在大腦和骨骼肌表現(xiàn)最為明顯，抑制其表達可引起肌肉骨骼異常和神經(jīng)系統(tǒng)問題，比如Williams綜合癥[3]。人類膠質(zhì)母細胞瘤的Fz9表達高于正常的大腦組織細胞[4]。增加Fz9的表達可增強星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤的致癌作用及促進癌細胞生長。

有研究表明，F(xiàn)z9表達在所有的肝癌細胞中，并且Fz9參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。而Fz9正常情況下不表達于胎兒和成人肝，通過RNAi介導FZ9基因沉默后，通過MTS分析可導致肝癌細胞的移動能力下降，而通過免疫印跡方法檢測到被Fz9-siRNA轉(zhuǎn)染的細胞，可下調(diào)細胞周期蛋白D1，而后者是Wnt途徑中的關(guān)鍵因子[5]。這表明Fz9抑制細胞增殖通過細胞周期，而不是通過細胞凋亡。所以Fz9被認為與肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)。

本實驗為明確證實本研究中所用的FZ9-siRNA能有效沉默F(xiàn)Z9基因。本研究從mRNA水平證實轉(zhuǎn)染si-RNA對FZ9基因表達的影響。不僅證實Fz9存在于肝癌細胞HepG-2中，并且通過RNAi介導的FZ9基因沉默，抑制了肝癌細胞株HepG-2的FZ9表達，通過Transwell小室模型檢測被剔除了FZ9基因HepG-2細胞移動能力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組與空白對照組有統(tǒng)計學差異，表明FZ9基因可以促進腫瘤細胞的侵襲，本實驗研究結(jié)果與Tatsuya[6]等人的研究相似。因為Fz9-siRNA不會影響周圍正常肝組織，所以Fz9-siRNA基因沉默有應(yīng)用于臨床的可能，為肝癌的基因治療提供實驗依據(jù)。

總之，本研究證明了Fz9是肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的一個重要因素，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Fz9基因可以作為一個靶基因治療原發(fā)性肝癌。

參考文獻

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