海南特有安諾蘭DNA提取方法研究方法研究

任軍方 姜殿強(qiáng) 覃瓊瑤 云勇

摘 要：以安諾蘭為試驗(yàn)材料，研究改良的CTAB法對(duì)安諾蘭不同部位（老葉、嫩葉、氣生根、花序、花苞）進(jìn)行基因組DNA的提取，利用核酸蛋白測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。結(jié)果表明，安諾蘭嫩葉的DNA提取從純度和提取率均優(yōu)于其他部位；花苞次之；花序DNA提取有少量的雜質(zhì)污染， 老葉有少量RNA殘留， 氣生根則質(zhì)量低。

關(guān)鍵詞：安諾蘭；DNA提?。籌SSR

中圖分類號(hào) Q949.71+8.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1007-7731（2013）09-22-03

安諾蘭（Anota hainanensis RolfeSchltr），又名海南鉆喙蘭，是蘭科安諾蘭屬唯一的一個(gè)種，是海南特有種，為多年生常綠附生亞灌木狀草本植物，屬典型的熱帶附生蘭。產(chǎn)于海南中南部低海拔丘陵地區(qū)，其性喜高溫、通風(fēng)、光照充足的氣候環(huán)境，耐干旱，畏濕，畏寒冷，春節(jié)前后開(kāi)花，是春節(jié)期間頗受歡迎的賀歲應(yīng)節(jié)蘭花品種。因具有很高的觀賞和藥用價(jià)值，其野生資源被掠奪性采伐，造成資源枯竭。目前對(duì)海南安諾蘭的研究主要在其栽培[1]和組織培養(yǎng)[2]等方面，尚未見(jiàn)報(bào)道有關(guān)海南安諾蘭種質(zhì)資源收集、遺傳多樣性的研究。

ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增）是由Zietkiewicz等[3]人于1994年提出的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有快速、穩(wěn)定性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[4]。ISSR標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記[5]，具有很好的穩(wěn)定性、多態(tài)性[6]，而且無(wú)需預(yù)知研究對(duì)象的基因組序列而設(shè)計(jì)特異引物，操作簡(jiǎn)單，因此該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于品種鑒定[7]、基因定位及遺傳多樣性分析中[8-9]。高質(zhì)量的總DNA及穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系是獲取可靠分子標(biāo)記結(jié)果的前提[10]，為此，筆者擬研究獲得高質(zhì)量安諾蘭基因組DNA的提取方法，并建立安諾蘭ISSR反應(yīng)體系，為該分子標(biāo)記技術(shù)在海南安諾蘭種質(zhì)資源研究和遺傳育種中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料來(lái)自于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所蘭圃的安諾蘭，選取安諾蘭不同部位—老葉、嫩葉、氣生根、花序、花苞為材料。

1.2 DNA提取方法優(yōu)化 經(jīng)過(guò)改良的CTAB提取方法：（1）取材料1g加少量的PVP，在液氮中研磨至白色粉末狀，將粉末迅速轉(zhuǎn)入2.0mL的離心管中，放入冰盒備用。（2）每份樣品加入1.5mL 60℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，輕輕搖勻，放在冰上。（3）等所有提樣品都研磨完以后，12 000rpm，4℃，離心5min，丟棄上清液。（4）加入約750mL預(yù)熱60℃的裂解緩沖液，充分搖勻，65℃水浴45min，每隔20min搖1次，使其充分混勻。（5）加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）提取液搖勻至白色乳濁狀，用10 000rpm，25℃，離心20min；將上清液轉(zhuǎn)入新的2mL離心管中。（6）加入1/10體積3M乙酸鈉（pH5.2）和0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，緩慢搖勻至有絮狀沉淀物析出，常溫下靜置至少1h。（7）用6 000rpm，25℃，離心15min，倒掉上部液體，用75%乙醇洗3次，通風(fēng)櫥柜風(fēng)干后加入200μL×TE溶解DNA。（8）加入10μg/μL的Rnase 3μL，37℃水浴1h。（9）加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提液，搖床輕輕搖30min。（10）用10 000rpm，25℃，離心15min，將上清液體轉(zhuǎn)入新的2mL離心管。（11）加入等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提液再抽提一次。（12）用10 000rpm，25℃，離心15min，將上清液轉(zhuǎn)入新的2mL離心管，加入1/10體積的3M乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的冰凍無(wú)水乙醇，慢慢搖勻至沉淀物析出，用槍頭挑出沉淀，用75%乙醇洗3次，至無(wú)乙醇味道，在通風(fēng)櫥柜風(fēng)干1～2h，DNA呈薄片透明狀時(shí)加入50μL×TE溶解。輕輕彈，至樣品完全溶解，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA樣品檢測(cè)

1.3.1 紫外光譜檢測(cè) 用超純水稀釋少量基因組DNA（稀釋100倍），并用超純水作為空白，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280比值及DNA的濃度。DNA樣品按100倍稀釋后測(cè)定其在260nm和280nm處的紫外吸收值，OD260/OD280的比值表示DNA樣品的純度，可判斷有無(wú)蛋白質(zhì)、多糖、RNA等雜質(zhì)（王關(guān)林等，2002）。若OD260/OD280值介于1.8～2.0，則表明DNA純度較好，如果OD260/OD280小于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染；若OD260/OD280值大于2.0，表明DNA樣品里面有RNA污染。然后根據(jù)OD比值計(jì)算出DNA的濃度和提取率。計(jì)算公式為：DNA濃度（μg/μL）=D260nm×100×稀釋倍數(shù)/1 000；DNA提取率（μg/g）=DNA濃度（μg/uL）×提取的DNA體積（μL）/試驗(yàn)材料的用量（g）。DNA濃度（μg/mL）=OD260×樣品稀釋倍數(shù)×100。將檢測(cè)后的DNA，稀釋至30ng/μL，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 取1μL稀釋好的DNA樣品，每個(gè)樣品加入5μL10×loading buffer混勻，于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，電泳40min，電泳結(jié)束后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon4100）觀察DNA譜帶，并拍照。

1.4 ISSR-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè) ISSR-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：反應(yīng)產(chǎn)物在含有0.5μg/mLGoldview染料的1.8%瓊脂糖凝膠電泳中分離，用DNA Marker（2 000bp）作為相對(duì)分子量標(biāo)記，以100V電壓電泳60min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon4100）下觀察并照相。

擴(kuò)增程序參照Z(yǔ)ietkiewicz等（1994），具體為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，引物在篩選后的最佳退火溫度退火55s，72℃延伸1min30s，共計(jì)36個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增在Biometra公司的T1PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果與檢測(cè) 經(jīng)過(guò)改良的CTAB法提取的安諾蘭基因組DNA呈白色絮狀，通風(fēng)櫥柜自然吹干后為白色透明薄片狀，加入3%β-巰基乙醇和2%PVP40，避免了多糖、多酚等次生物質(zhì)的擾亂，有效防止了褐變。經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的OD值，其OD值都在1.799～2.300，說(shuō)明該法能較完全地去除蛋白質(zhì)、酚類及多糖等雜質(zhì)，對(duì)殘留的氯仿、無(wú)機(jī)鹽等也能去除干凈，適合對(duì)安諾蘭DNA基因組的提取。

用0.8%的瓊脂糖膠檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量表明：用改良的CTAB法提取的安諾蘭基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳上能呈現(xiàn)清楚的DNA光亮條帶，不彌散，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象（圖1）。

圖1 安諾蘭DNA0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

注：1～4為安諾蘭花序；5～8為安諾蘭嫩葉；9～12為安諾蘭苞葉；13～16為安諾蘭氣生根；17～20為安諾蘭老葉。

2.2 不同部位DNA的純度和提取率 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各個(gè)處理的DNA的D260nm、D280nm值，分別計(jì)算出D260nm/D280nm、DNA濃度和提取率（表1）。結(jié)果表示，安諾蘭嫩葉提取率和純度都很高，D260nm/D280nm處于1.8～2.0，老葉的D260nm/D280nm大于2.0，表明樣品還有RNA污染，須進(jìn)一步除RNA。從提取率看嫩葉的提取率最高，其次是苞葉和花序，氣生根和老葉純度和提取率均很低。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果，安諾蘭不同部位DNA的提取純度都很高，表明安諾蘭的5個(gè)不同部位都可以進(jìn)行DNA的提取，但是DNA提取濃度和提取率各不相同，嫩葉的提取率最高，苞葉和花序次之，老葉和氣生根提取率低。安諾蘭的老葉由于提取率低，有雜質(zhì)污染，且質(zhì)地較硬，很難研磨，最好不選用進(jìn)行DNA的提取。氣生根提取率也不高，且根系損傷對(duì)植株生長(zhǎng)影響較大，為不使整株受影響，根系提取DNA也不可行。苞葉和花序可作為安諾蘭DNA提取的選擇材料，但以嫩葉的提取率最高，且純度好，提取過(guò)程中要注意RNA的污染。

本實(shí)驗(yàn)用改良的CTAB法適合安諾蘭基因組DNA的提取，且DNA的質(zhì)量好，純度高，完全能滿足安諾蘭ISSR-PCR擴(kuò)增的要求。

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（責(zé)編：張宏民）