骨架蛋白肌聯蛋白、伴肌動蛋白、紐蛋白的降解對冷卻豬肉持水性的影響

杞斯卡娜 鄭偉 陳韜 張冬怡

摘 要：肉的持水性可用許多指標衡量，而汁液流失率（drip loss）是其中一個重要指標。持水性受很多因素影響，但目前對形成汁液流失的機理的認識還很有限。本文綜述了近幾年來國內外學者對持水性的研究，主要分析了宰后骨架蛋白（肌聯蛋白、伴肌動蛋白、紐蛋白）的降解及鈣激活蛋白酶系統(tǒng)降解骨架蛋白對持水性的影響，以期為宰后豬肉持水性提高和肉品質改善提供參考。

關鍵詞：持水性；汁液流失；骨架蛋白；降解

Effect of Postmortem Degradation of Cytoskeleta Proteins： Titin， Nebulin and Vinculin on Water-Holding

Capacity of Chilled Pork

QI Si-ka-na，ZHENG Wei，CHEN Tao，ZHANG Dong-yi

（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract：Drip loss is an important measure of the water-holding capacity of raw meat， which is affected by many factors. However， there is only limited knowledge about the formation mechanism of its drip loss. This article reviews recent Chinese and foreign studies on the water-holding capacity of raw meat. This review highlights the postmortem degradation of cytoskeleta proteins： titin， nebulin and vinculin and the water-holding capacity of raw meat as a function of calpain activities， aiming at providing references for improving the postmortem water-holding capacity and quality of chilled pork.

Key words：water-holding capacity；drip loss；cytoskeletal protein；degradation

中圖分類號：TS251 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）03-0042-04

肉的質量指標主要包括顏色、滋味、質地、多汁性和氣味等，它能直觀反映出肉的品質。動物屠宰后肌肉保持自身水分的能力被稱之為持水性（WHC）。持水性與冷卻肉的感官品質和肉類企業(yè)的經濟效益密切相關，是冷卻肉最重要的品質之一。有許多指標可用來衡量持水性，但汁液流失率（drip loss）和貯藏損失（purge loss）用的最多，其范圍一般在0.1%～10%之間。

我國因人口眾多，肉類產量已連續(xù)15年穩(wěn)居世界第一位，2011年全國肉類總產量已達7957萬t，其中豬肉占5053萬t。冷卻肉是指對嚴格執(zhí)行檢驗檢疫制度屠宰后技術獲得的可食用胴體進行迅速冷卻處理，使胴體溫度在24h內降至0～4℃，并在后續(xù)加工、流通和銷售過程中溫度保持在0～4℃范圍內的鮮肉。冷卻肉具有安全系數高、營養(yǎng)價值高、感官舒適性高等優(yōu)點，是我國肉類行業(yè)技術發(fā)展的重點之一[1]。20世紀80年代，我國開始了對冷卻肉的研究與生產，但由于經濟、技術等方面的原因，發(fā)展相對滯后。近年來，雖然我國的肉品工業(yè)得到了長足的發(fā)展，但始終使肉品銷售者頭疼的是，冷卻肉普遍存在貨架期短（僅3～5d）、表面易褐變，汁液流失嚴重、肉品持水性低，多汁性差等問題[2]。由于冷卻肉的持水性差，在加工、運輸和銷售過程中將產生大量的汁液流失，不但使產品重量減少，影響肉的外觀、嫩度，給生產企業(yè)帶來重大經濟損失，同時大量的蛋白質流失還降低了肉的營養(yǎng)價值。肉在分割、儲藏過程汁液流失率范圍可達2%～10%之間[3]，據初步調查，目前我國冷卻肉的汁液流失率為3.0～5.0%，平均比發(fā)達國家高出1.5%以上，每年因汁液流失造成的肉類重量損失折合人民幣達數億元。因此，如何將汁液流失率控制在最低限度以內是全球肉類研究者共同的目標。

1 肌肉中蛋白概述

1.1 肌肉中的水分和蛋白質

肌肉中的水分含量大約是75%，他們主要存在于肌原纖維中、肌原纖維間、肌原纖維與細胞膜間，細胞間和肌束間的空隙中[4]。水是兩性分子，與蛋白質分子中的電荷相互吸引而結合在蛋白質分子上的稱為結合水，占肌肉水分的很小比例；受空間效應的影響存在于肌肉中，但不與蛋白質結合的部分叫不易流動水；能在肌肉中自由流動，存在于肌細胞外間隙的水稱為自由水。宰后，結合水基本不變；僵直成熟過程中，不易流動水受顯著影響；肌肉轉變成肉的過程中，受影響最大的是不易流動水。

肌纖維是骨骼肌的基本構成單位，主要由肌纖維膜、細胞核、肌漿以及大量的肌原纖維組成，其中肌漿約占肌細胞的30%，肌原纖維約占肌纖維的70%。肌原纖維由20%的蛋白質和80%的水組成，并且占有瘦肉中約80%的細胞空間[5]。肌肉中大量的水分與蛋白質的極性基團結合形成水合離子而儲留在蛋白質的空間結構中，這是肌肉持水性的原因[6]。有報道指出，肌原纖維蛋白質的變性程度和持水性降低密切相關[7]。Greaser等[8]提出，豬剛屠宰時的肉的pH值接近7，約1h后開始下降，經僵直過程后，最低pH值于5.4～5.6之間，而后隨著僵直解除及成熟時間的延長，pH值緩慢上升，肌纖維收縮減輕，持水力上升。同時另有報道指出，蛋白質的降解和肉的持水性也有關系[9]。

1.2 骨架蛋白概念及分類

骨架蛋白指的是把肌原纖維和細胞膜連接在一起，對肌肉收縮起到調節(jié)和穩(wěn)定作用，以維持細胞結構的蛋白質。骨骼肌細胞骨架按位置不同可分為肌小節(jié)內骨架、肌小節(jié)外骨架和肌細胞膜骨架[10]。細胞骨架蛋白以細絲狀存在，與粗絲和細絲平行排列，也叫間隙纖絲（gap filaments）。他們存在于肌原纖維的間隙，可以起到連接肌節(jié)的作用，當肌肉高度收縮時用電子顯微鏡能夠觀察到這種纖絲的橋梁作用[11]。肌小節(jié)外骨架主要由中等纖維（intermediate filaments）組成，它位于肌原纖維周圍，連接于Z盤、核膜和肌細胞膜之間，包括肌間線蛋白（desmin）、巢蛋白（nestin）、核纖層蛋白（lamins）、波形纖維蛋白（vimentins）以及細胞角蛋白（cytokeratins）。其中，主要的肌肉特異性的中等纖維是肌間線蛋白。連接蛋白和伴肌動蛋白是肌小節(jié)內的主要骨架蛋白，肌細胞膜骨架蛋白包括跨膜的和與膜相連的蛋白，如紐蛋白（vinculin）、連接蛋白（intergrins）、膜收縮蛋白（spectrin）、抗肌萎縮蛋白（dystrophin），這些蛋白將肌細胞內的肌原纖維和胞外的基質間接聯結起來，而其中的紐蛋白和連接蛋白與細胞肌膜中的核纖層蛋白有聯結，在細胞內與微絲相聯結，對細胞彼此間的附著具有重要作用。

2 骨架蛋白變化與持水性關系

2.1 汁液流失形成機理

國外在20世紀60年代開始研究冷卻肉汁液流失形成的機理，人們認為，豬宰后僵直期間，由于pH值和鈣離子的誘導使得肌原纖維收縮，使肌纖維內水分外流形成汁液流失[12-13]，新鮮豬肉的汁液流失率與僵直收縮程度、細胞膜滲透壓等因素相關，研究發(fā)現，肌肉骨架蛋白質的變化和肉的持水性也有關系。

1995年，Huff-Lonergan等[9，14]研究表明宰后肌肉的蛋白質降解通常伴隨著嫩度變化，也可能伴隨著汁液流失。實驗表明連接肌原纖維與細胞膜的蛋白（如肌間線蛋白）降解時，這些蛋白的收縮會導致肌原纖維網格結構收縮，最終導致整個肌細胞收縮，形成汁液流失通道，從而增加汁液流失[15]。因此蛋白質降解強度增大可能會阻礙肌原纖維收縮，從而減少汁液流失；Kristensen等[15]認為持水性的增加是由于骨架蛋白質的降解使肌細胞橫向膨脹的結果；2004年Lawson[16]研究表明汁液流失通道形成于肌細胞膜和肌纖維分開的位置，此通道的形成是由于鈣蛋白酶降解了肌動骨架蛋白和細胞膜之間的連接蛋白（intergrin）。但Sch?fer等[17]在研究宰后3～24h骨架蛋白變化與持水性關系時發(fā)現，肌肉骨架蛋白的降解與汁液流失無關。

可見，宰后肌肉蛋白質的降解和汁液流失的關系至今尚未搞清楚，對冷卻肉汁液流失形成機理認識還十分有限。開展宰后肌肉蛋白質變化與冷卻肉持水性的關系研究，有助于揭示冷卻肉的汁液流失形成機理。

由于各骨架蛋白在肌肉中所處位置不同，起到的連接作用不同，對宰后肌肉持水性的影響也不盡相同，如肌聯蛋白（titin）、伴肌動蛋白（nebulin）和紐蛋白（vinculin）。

2.2 肌聯蛋白和伴肌動蛋白的降解對持水性的影響

肌聯蛋白是橫紋肌中的彈性蛋白，約占肌原纖維蛋白質量的10%[18]，可能是細胞骨架蛋白的主要蛋白，也是目前所發(fā)現的最大的單鏈蛋白，其分子質量約為3000kD[19]，一個肌連蛋白分子可從Z盤到M線，長達1μm。肌連蛋白有兩個主要作用：（1）通過連接各種蛋白質，控制肌節(jié)的各成分組成；（2）將粗肌絲與Z-線連接，以維持肌原纖維的完整性和穩(wěn)定性，保持舒張肌肉的靜息張力，使粗肌絲處于肌小節(jié)的中央位置，是受牽拉的肌肉可恢復初始狀態(tài)和保證肌肉收縮的張力輸出。在肉的成熟過程中，由于內源性酶的作用，肌連蛋白很易發(fā)生水解，這些內原酶包括鈣激活酶（calpain）和羧基蛋白酶（carboxyprotease）[20]。

伴肌動蛋白（nebulin）的分子質量約為800kD[21]，其在肌原纖維蛋白中的含量約為5%[22]。當肌肉處于松弛狀態(tài)時，伴肌動蛋白起源于Z盤，延伸至I帶，連接于Z盤與Z盤之間，平行于A帶中的肌動蛋白（actin），其主要作用是保持肌動蛋白的正常結構。此外伴肌動蛋白可以附著在間隙纖絲的連接蛋白上，在肌原纖維中起到結構和調節(jié)作用。

研究表明，每半個肌節(jié)中都有6個肌聯蛋白和伴肌動蛋白，它們源于M線，螺旋纏繞于A纖絲，延伸至鄰近Z線[22]。這兩種蛋白在在宰后發(fā)生降解，他們的降解作用累加在一起可能會促使肌原纖維小片化，而肌原纖維小片化指數升高可能會導致肉嫩度的提高。Wang等[23]報道，宰后早期，肌聯蛋白蛋白是成對存在的，即T1（未降解的肌聯蛋白）與T2（肌聯蛋白的大分子降解產物）。Huff-Lonergan等[24]經SDS-PAGE電泳對肌聯蛋白和伴肌動蛋白蛋白研究知，宰后0～3d，T1與T2成對清晰可見，宰后3天T1降解，T2比T1更為清洗可見，并有分子質量1200kD的多肽降解物產生，且無完整的伴肌動蛋白條帶。Rees等[25]發(fā)現宰后電刺激引起汁液流失增加的同時，SDS-PAGE電泳顯示肌連蛋白的降解程度增加。2011年，Farouk等[26]報道，牛宰后21d內汁液流失增加，而隨著儲藏時間的延長汁液流失下降，同時，SDS-PAGE電泳顯示，宰后21d起，有大量肌連及伴肌動蛋白降解產物生成。

2.3 紐蛋白的降解對持水性的影響

紐蛋白也是細胞骨架蛋白，其作用是連接肌動蛋白和細胞膜，呈弓肋狀排列，位于Z線處，分子質量約為126kD[21]。2001年Kristensen等[15]經對豬骨架蛋白的Western Blot分析發(fā)現，宰后1d紐蛋白、踝蛋白（talin，225kD）開始降解，肌間線蛋白（55kD）未見降解，第4天踝蛋白降解了68%，而肌間線蛋白、紐蛋白只有輕微降解，到宰后10d，肌間線蛋白和紐蛋白降解了71%和63%；同時觀察到宰后1d水分損失為3.9%，宰后3d升至11.9%（即持水性下降），7d后持水性增加，10d后持水性回升至4.5%。同時，他發(fā)現紐蛋白和肌間線蛋白、踝蛋白在宰后成熟過程中被水解，細胞骨架的破壞使得骨骼肌膜結構遭到破壞，將水向細胞外推斥的作用力不復存在，從而提高了肌肉的持水能力。

3 影響骨架蛋白降解的鈣蛋白酶系統(tǒng)

鈣蛋白酶是細胞內依鈣中性半胱氨基酸巰基內肽酶，是由鈣調蛋白和木瓜蛋白酶以非共價鍵結合成的嵌合體，主要分布在肌原纖維的Z盤附近。根據該蛋白酶表現最高活性所需的Ca2+濃度不同可將其分為μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶兩種，二者均具有水解肌原纖維蛋白的活性。Koomaraie[27]發(fā)現在有Ca2+存在的情況下，鈣蛋白酶會開始自溶，降低了滿足其最大活性的Ca2+需要量，使其被激活。鈣蛋白酶自溶時所需的Ca2+濃度與其表現蛋白質水解酶活性所需的Ca2+濃度很相近，且自溶的鈣蛋白酶疏水性更強，與肌原纖維結合更牢固，因此鈣蛋白酶自溶體的出現被認為是鈣蛋白酶被激活的表現。Suzuki等[28]發(fā)現鈣蛋白表達量的減少會導致肌肉蛋白的水解。宰后活體的Ca2+濃度只能激活μ-鈣蛋白酶而不能激活m-鈣蛋白酶，因此，μ-鈣蛋白酶被認為是降解肌原纖維的主要作用酶。許多與嫩度和汁液流失相關的蛋白質都是μ-鈣蛋白酶的底物，如肌聯蛋白、伴肌動蛋白、紐蛋白、結蛋白（desmin）、肌源蛋白T（troponin-T）等，但不降解α-肌動蛋白（α-actin）、肌球蛋白（myosin）等。因此推測，鈣蛋白酶可能是通過對肌原纖維蛋白進行特異的局部降解從而實現對肌原纖維蛋白結構和功能的調控的。據推測鈣蛋白酶所誘導的肌肉降解分為兩步：首先，攻擊肌原纖維的肌節(jié)部位（兩相鄰Z盤之間的一段肌原纖維），釋放肌絲使其降解為小片段，然后被溶酶體捕獲而進一步降解[29]，破壞了肌原纖維的有序性和完整性，從而改善肌肉的持水性。

2005年，Lawson[30]提出了一個新的有關汁液流失形成的機理，他認為宰后早期，動物屠體進入尸僵狀態(tài)，肌原纖維收縮使得肌原纖維間的水分流出。如果尸僵前鈣蛋白酶被激活且降解連接蛋白（intergrin），在肌纖維收縮時，細胞膜就會與肌原纖維分離而形成汁液流失通道。如果在尸僵前抑制鈣蛋白酶活性，阻止了連接蛋白的降解，從肌原纖維間流出的水分就會進入肌纖維周圍的結締組織間，由于結締組織具有很好的持水力，水分不會外流，從而降低汁液流失，即鈣蛋白酶活性越高，汁液流失率越高。

4 結 語

影響豬肉持水性的因素很多，但歸結到肌肉的生理和生化水平上，蛋白質的變化對持水性的影響尤為重要，特別近年來的一些研究發(fā)現宰后肌肉骨架蛋白的降解使得肌原纖維網格結構收縮時會導致在細胞間和肌束間形成汁液流失通道。但是，由于各個骨架蛋白在細胞內所處的位置及功能的不同，其與持水性呈現出的相關性也不同。甚至還有研究報道骨架蛋白的降解與持水性關系不緊密，因此，骨架蛋白降解與持水性的關系還有待進一步研究。

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