葡萄糖氧化酶活性變化的分析

周生民，趙 偉

（山東福洋生物科技有限公司，山東 德州 253100）

葡萄糖酸鈉是一種多羥基羧酸鈉，白色結(jié)晶顆?；蚍勰瑯O易溶于水，微溶于酒精，不溶于乙醚，又被稱為五羥基已酸鈉，分子式為C6H11O7Na，分子質(zhì)量為218.14，含量大都在98%以上。目前，葡萄糖酸鈉生產(chǎn)普遍采用黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)黑曲霉發(fā)酵中產(chǎn)生的酶有過氧化氫酶、纖維素酶、半乳糖酶、葡萄糖氧化酶等20多種酶[1-2]。其中，葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化反應(yīng)中起主導(dǎo)作用。因此，對(duì)葡萄糖氧化酶的研究直接影響葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)。

葡萄糖氧化酶系統(tǒng)稱為β-D-葡萄糖氧化還原酶（glucose oxidase，GOD），是一種淡黃色透明液體酶制劑，能催化葡萄糖氧化成葡糖酸并產(chǎn)生過氧化氫的酶。該酶含有兩分子黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的黃素蛋白，圖1為葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖為葡萄糖酸的反應(yīng)機(jī)理[3-4]。

葡萄糖氧化酶的pH穩(wěn)定范圍較寬，在pH4～8范圍內(nèi)較穩(wěn)定。酶蛋白在pH5.0～5.5范圍酶活基本不變，在pH6～8范圍內(nèi)也較穩(wěn)定，酶活力均保持在72%以上。葡萄糖氧化酶蛋白在20℃～50℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性很好，30℃時(shí)酶活力比原酶活力可上升16%，60℃時(shí)酶活力下降至51%，70℃時(shí)下降更為顯著[5]。葡萄糖是該酶的穩(wěn)定劑，一般來說，酶反應(yīng)受底物濃度的影響不大，葡萄糖濃度為5%～20%，反應(yīng)速度幾乎不變[6]。

葡萄糖酸鈉具有非常廣泛的用途，在建筑業(yè)中被廣泛用作水泥緩凝劑，可以防止混凝土在運(yùn)輸?shù)倪^程中凝固和結(jié)塊現(xiàn)象，另外還可被用作鋼鐵表面清洗劑、阻垢緩蝕劑。食品級(jí)和醫(yī)藥級(jí)產(chǎn)品，可以調(diào)節(jié)人體的酸堿平衡，有效防止低鈉綜合癥的發(fā)生，用作食品添加劑和醫(yī)藥中間體等。

圖1 葡萄糖氧化酶氧化機(jī)理Fig.1 Oxidation mechanism of glucose oxidase

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）：福洋生物科技有限公司保藏菌種。

1.2 儀器與設(shè)備

小型在線檢測發(fā)酵罐：國強(qiáng)生化有限公司；722紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；電爐：武漢嘉華爐業(yè)有限公司；MAX300LG質(zhì)譜儀：杭州瑞析科技有限公司；XSPBM-2CBAC顯微鏡：西派克光學(xué)儀器有限公司；HA-HH-4恒溫水浴鍋：環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

葡萄糖氧化酶酶活定義：在pH5.6，溫度為30℃條件下，每分鐘催化1μmol葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過氧化氫所需的葡萄糖氧化酶的量為一個(gè)酶活力單位（U）。

根據(jù)酶的pH穩(wěn)定性和底物濃度穩(wěn)定性，選擇發(fā)酵液pH5.2左右和糖濃度19%時(shí)取發(fā)酵液過濾處理，在酶活相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境下測定此時(shí)酶活并記錄。取4支離心管分別標(biāo)號(hào)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，將過濾后的發(fā)酵液分別裝入4支離心管，將Ⅰ號(hào)離心管存放在4℃冰箱內(nèi)，將Ⅱ號(hào)離心管常溫25℃保存，Ⅲ號(hào)離心管放入37℃恒溫箱保存，Ⅳ號(hào)離心管放入70℃恒溫箱保存，每1h檢測1次酶活并記錄。

酶活檢測：分別添加2.4mL用無水乙酸鈉稀釋的鄰聯(lián)茴香胺、0.5mL 10%葡萄糖溶液、0.1mL辣根過氧化氫酶溶液于35℃水浴鍋提前預(yù)熱5min。檢測時(shí)向混合溶液中添加0.1mL過濾后的發(fā)酵液，于波長500nm處每30s記錄吸光度值（A500nm），每30s記錄一次，以A500nm對(duì)時(shí)間作圖，找出最大斜率△A/min。酶活計(jì)算公式如下：

注：7.5為氧化型鄰聯(lián)茴香胺的消光系數(shù)。

測定過程中維持發(fā)酵液葡萄糖氧化酶活性測定結(jié)果在1000U/mL左右為宜，活性過高則應(yīng)稀釋，不得超過5000U/mL。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)葡萄糖氧化酶pH穩(wěn)定性和底物濃度穩(wěn)定性，對(duì)所取樣品進(jìn)行檢測，測得的pH值為5.3，葡萄糖濃度為18%，都處于葡萄糖氧化酶活力穩(wěn)定范圍[7]。每1h對(duì)所取的3個(gè)處于不同溫度的樣品進(jìn)行酶活性檢測。

圖2 不同溫度下酶活隨時(shí)間的變化趨勢Fig.2 Change of enzyme activity at different temperatures

從圖2可以看出，保存于4℃的樣品不同時(shí)間所測得的酶活性基本接近于初始值，保存于25℃、37℃和70℃的樣品都偏離初始值，25℃時(shí)所測得的酶活性呈上升趨勢，比初始值有所上升，而37℃和70℃時(shí)所測得的酶活性有下降趨勢，并且溫度處在70℃時(shí)酶活性下降最明顯。

從圖2還可以看出，葡萄糖氧化酶活性范圍比較寬，從4℃～70℃葡萄糖氧化酶都存在活性，4℃和25℃葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性都比較好，而25℃更接近于真實(shí)值，37℃和70℃葡萄糖氧化酶波動(dòng)較大不能真實(shí)反映酶的活性，從酶的動(dòng)力學(xué)方面看，可能是溫度對(duì)酶的活性基團(tuán)有一定的影響，才改變了不同溫度下酶的活性[7-9]。

3 結(jié)論

在產(chǎn)葡萄糖酸鈉的黑曲霉發(fā)酵過程中，氧化葡萄糖形成葡萄糖酸鈉的酶是葡萄糖氧化酶，其活性決定了耗糖速率大小和產(chǎn)酸的快慢，所以研究酶活性的變化趨勢相當(dāng)重要[10-11]。發(fā)酵液中酶活性在取樣之后立刻檢測才能較真實(shí)反映酶的活性，從圖2中可以看出，酶在4℃時(shí)酶活性基本保持與初始值相似基本反映發(fā)酵過程中酶活力的大小。而25℃、37℃和70℃時(shí)酶活性都偏離了初始值，也就都偏離了發(fā)酵罐中酶的真實(shí)活性[12-13]。

葡萄糖酸鈉發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物發(fā)酵過程，其中存在各種酶參與的各種復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，只有了解了酶活的變化趨勢才能更好的控制生產(chǎn)工藝，才能使發(fā)酵過程中的酶達(dá)到最高效的催化氧化的效果，產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量才能進(jìn)一步得到提高[14-15]。

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