不同氮濃度對紫球藻生長及藻膽蛋白和葉綠素a含量變化的影響

鄭彩云，盧偉婷，王 艷，張崇禧*

（山東大學(xué)威海分校 海洋學(xué)院，山東 威海 264209）

紫球藻（Porphyridiumcruentum）屬于紅藻門（Rhodophyta），紅毛菜綱（Bnagiophyeeae），紫球藻目（Porphyridium hrtidiales），紫球藻科（Porphyridium hyridiaceae）。紫球藻屬（Porphyridium nageli.）是一種比較原始的單細(xì)胞紅藻，其廣泛分布于海水、淡水及潮濕的土壤中，其細(xì)胞呈球形，大約8μm～15μm，細(xì)胞外包圍著一層粘質(zhì)鞘，因粘質(zhì)鞘的相互粘連而使多個細(xì)胞不規(guī)則的聚成一團(tuán)，固體培養(yǎng)形成一個薄層，液體培養(yǎng)則出現(xiàn)附壁或呈團(tuán)狀沉淀現(xiàn)象。紫球藻在生長過程中能夠合成藻膽蛋白、高不飽和脂肪酸及硫酸脂多糖等多種生物活性物質(zhì)，其應(yīng)用領(lǐng)域涉及醫(yī)藥、保健食品、化妝品、精細(xì)化工等多種高附加值產(chǎn)業(yè)，是一種極具研究應(yīng)用價值的經(jīng)濟(jì)微藻。

目前，紫球藻的研究主要集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化改良，特別是其多種生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用方面，而鹽度對紫球藻生長代謝影響的報道甚少。在紫球藻培養(yǎng)方面，雖然通過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了各種生長影響因子，初步建立了光生物反應(yīng)器的高密度培養(yǎng)體系，但其實(shí)際培養(yǎng)效果無論從藻體的數(shù)量還是質(zhì)量方面都與規(guī)?；?、商業(yè)化生產(chǎn)要求存在一定的差距。本論文對不同氮磷濃度條件下紫球藻的生長代謝進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，得到了不同氮磷濃度對藻體的生長特性及葉綠素、藻膽蛋白單位積累量的影響，以期為進(jìn)一步細(xì)化紫球藻的高密度培養(yǎng)工藝提供實(shí)驗(yàn)理論與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

紫球藻（Porphyridium cruentum）實(shí)驗(yàn)用藻株系由山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院分離純化和篩選的純種，采用f/2海水培養(yǎng)基保種培養(yǎng)。

f/2海水培養(yǎng)基成分：硝酸鈉74.8mg/L，磷酸二氫鈉0.2g/L。

f/2微量元素1mL/L（硫酸鋅23mg/L、氯化錳178mg/L、硫酸銅10mg/L、乙二胺四乙酸二鈉4.35mg/L、氯化鉆12mg/L、檸檬酸鐵3.9g/L、氯化鉆12mg/L、四氧化鉬8mg/L）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)海水

實(shí)驗(yàn)所用海水取自山東大學(xué)威海分校近海海域，120℃高溫滅菌20min后使用。

1.2 儀器與試劑

JYD-650L超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：上海之信儀器公司；LXJIIR低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；721E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用藥品、試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藻體計數(shù)

取1mL藻體稀釋10倍，以0.1血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下直接計算藻細(xì)胞數(shù)量。

1.3.2 接種紫球藻

配制NaNO3母液（20g/L）KH2PO4母液（20g/L）。

在5個培養(yǎng)管中都加入2mL KH2PO4溶液、0.2mL微量元素、25mL種子液，再分別加入0.748mL、1.748mL、4.748mL、8.7488mL、12.748mL NaNO3溶液，每管加海水至體積為200mL，由此配出氮的濃度梯度為0、0.1g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L，通入空氣培養(yǎng)并設(shè)置一組平行組。

1.3.3 葉綠素a含量測定

經(jīng)研究證實(shí)，用分光光度計法測定葉綠素含量，對分光光度計的波長精確度要求較高。如果波長與原吸收峰波長相差1nm，則葉綠素a的測定誤差為2%，葉綠素b為19%，鑒于此點(diǎn)選擇葉綠素a作為藻生物指標(biāo)檢測質(zhì)。

取80mL藻液1500r/min離心10min，棄上清液用PBS洗2次，每次加入量5mL；洗好后棄上清，加入95%vol乙醇5mL避光振蕩后放入4℃冰箱黑暗提取24h，5000r/min下離心10min，上清液在波長665nm、649nm處測量光密度值，根據(jù)公式計算葉綠素a含量：葉綠素a（mg/L）=13.95×OD665－6.88×OD649。

1.3.4 藻膽蛋白含量的測定

用離心法采收鮮藻，定量藻泥用PBS（磷酸鹽緩沖液）溶解，-20℃反復(fù)凍融3次，然后放入離心管置冰浴中，分別以120W的功率破碎細(xì)胞，以超聲10s，間歇10s的方式進(jìn)行處理，處理40次。離心后取上清液，測定藻膽蛋白含量，以磷酸緩沖液做空白對照，分別測定波長620nm、650nm、680nm處的吸光度值，利用經(jīng)驗(yàn)公式計算藻膽蛋白含量[2]。

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與分析

2.1 不同NaNO3濃度對紫球藻生長的影響

不同NaNO3濃度時紫球藻的生長曲線（圖1）可知，不同NaNO3濃度時各組藻細(xì)胞的生長趨勢基本相同。接種后各實(shí)驗(yàn)組的藻體均處于靜止適應(yīng)階段，由于紫球藻存在附壁的特性以及適應(yīng)新環(huán)境，導(dǎo)致培養(yǎng)液的細(xì)胞密度明顯下降。從第2d開始，藻體進(jìn)入對數(shù)生長期，生物量迅速增大。不同NaNO3濃度對紫球藻生長趨勢影響較小，但NO3-含量的增加明顯有助于提高紫球藻的生長速率。當(dāng)NaNO3的添加量為0時，僅依靠海水中的本底硝酸鹽，紫球藻也能出現(xiàn)對數(shù)生長，但由于NO3-的缺乏，藻體生長速度均低于添加組。

2.2 不同NaNO3濃度對紫球藻代謝產(chǎn)物的影響

2.2.1 不同NaNO3濃度對紫球藻葉綠素a含量的影響

由圖2可知，隨著NaNO3濃度升高，紫球藻葉綠素a含量明顯增多。NaNO3添加量為0時，實(shí)驗(yàn)組總體葉綠素a含量和單位細(xì)胞葉綠素a的含量明顯低于其他各組。當(dāng)NaNO3的添加量為0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L時，藻體生長出現(xiàn)優(yōu)勢，葉綠素a含量相對較高。葉綠素含量的多少在一定范圍內(nèi)與NaNO3濃度呈現(xiàn)一定的依賴性。

圖1 不同NaNO3濃度下紫球藻的生長曲線Fig.1 Growth cuvres of Porphyridium cruentum at different concentration of NaNO3

圖2 不同NaNO3濃度下紫球藻葉綠素a含量變化圖Fig.2 The effect of different concentration of NaNO3 on the content of mebolic products

2.2.2 不同NaNO3濃度對紫球藻藻膽蛋白含量的影響

圖3 不同NaNO3濃度下紫球藻藻膽蛋白含量變化圖Fig.3 The effect of different concentration of NaNO3 on the content of mebolic products

由圖3可知，隨著NaNO3濃度升高，紫球藻藻膽蛋白積累含量明顯增多。NaNO3添加量為0時，該組總體藻膽蛋白含量和單位細(xì)胞的藻膽蛋白積累含量明顯低于其他各組。當(dāng)NaNO3的添加量為0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L時，藻體生長出現(xiàn)優(yōu)勢，藻膽蛋白含量相對較高。藻膽蛋白含量的多少在一定范圍內(nèi)與NaNO3濃度呈現(xiàn)一定的依賴性。

附表 不同NaNO3 濃度對單個紫球藻細(xì)胞代謝產(chǎn)物含量的影響Attached table The effet of diefferent concentration of NaNO3 on mebolic products of unit cell

3 討論

3.1 不同NaNO3濃度對紫球藻生長趨勢的影響

不同NaNO3濃度下各組藻細(xì)胞的生長趨勢基本相同，接種后各實(shí)驗(yàn)組藻體處于靜滯適應(yīng)階段。由于紫球藻存在附壁的特性以及需要適應(yīng)新環(huán)境，培養(yǎng)液的細(xì)胞密度明顯下降。第2d開始進(jìn)入對數(shù)生長期，生物量迅速增大。不同NaNO3濃度對紫球藻生長趨勢影響較小，但其含量增加明顯有助于提高紫球藻的生長速率。當(dāng)NaNO3添加為0時，僅靠海水中的硝酸鹽，紫球藻也能出現(xiàn)對數(shù)生長，但由于氮的缺乏，藻體生長幾天后隨即進(jìn)入靜止期。NaNO3高劑量組明顯體現(xiàn)出生長優(yōu)勢，其細(xì)胞密度始終高于各組對照。不同氮濃度對紫球藻生長趨勢影響較小，但氮含量的增加明顯有助于提高紫球藻的生長速率并延長其對數(shù)生長期。

3.2 不同NaNO3濃度對紫球藻代謝產(chǎn)物積累的影響

隨著NaNO3濃度升高，紫球藻葉綠素a與藻膽蛋白積累含量量明顯增多。第一組單位細(xì)胞的各項產(chǎn)量明顯低于其他各組。NaNO3添加量較低時，由于氮元素缺乏，消耗部分蛋白提供氮元素，又因葉綠素含量的偏低直接影響了藻體光合作用的能力及細(xì)胞對培養(yǎng)基中碳源的利用，細(xì)胞合成色素蛋白不足，最終導(dǎo)致其細(xì)胞數(shù)量上的差別；故蛋白含量較低。紫球藻在不同NaNO3濃度時生長穩(wěn)定期所含葉綠素a及藻膽蛋白的總量與藻體生長呈明顯的正相關(guān)規(guī)律，即藻體穩(wěn)定期細(xì)胞密度越大，代謝產(chǎn)物含量越高。

3.3 紫球藻積累產(chǎn)物在生產(chǎn)中的應(yīng)用及發(fā)展新方向

紫球藻作為一種被培養(yǎng)利用的海洋單細(xì)胞紅藻，因其在生長過程中合成藻膽蛋白、多不飽和脂肪酸（花生四烯酸、二十碳五烯酸等）和硫酸脂多糖等天然活性物質(zhì)，具有很大的經(jīng)濟(jì)價值及廣闊的應(yīng)用前景。硒（Se）是一種與人類健康密切相關(guān)的必需微量元素，是構(gòu)成生物體內(nèi)若干抗氧化物酶的活性中心。研究證實(shí)，硒具有清除自由基、防衰老、抗癌等生物學(xué)功能，含硒的生物大分子如硒蛋白、硒多糖具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、預(yù)防腫瘤等多種生理功能。而葉綠素a及藻膽蛋白等有助于硒的富。因此，對紫球藻進(jìn)行培養(yǎng)，并對其藻膽蛋白和葉綠素a的含量進(jìn)行了測定，為以后進(jìn)行紫球藻富集轉(zhuǎn)化硒等研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

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