胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾對(duì)免疫介導(dǎo)大鼠擴(kuò)張型心肌病的干預(yù)研究*

李鵬，賈志梅，馬春燕，謝成耀，劉軍，賈志軍

胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾對(duì)免疫介導(dǎo)大鼠擴(kuò)張型心肌病的干預(yù)研究*

李鵬，賈志梅，馬春燕，謝成耀，劉軍，賈志軍

目的：觀察胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾對(duì)免疫介導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌?。―CM）大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的干預(yù)作用，并探討其機(jī)制。

擴(kuò)張型心肌??；T 淋巴細(xì)胞亞群；胸腺五肽；比索洛爾

免疫功能的變化在擴(kuò)張型心肌?。―CM），的病情發(fā)展進(jìn)程中可能起重要的介導(dǎo)作用，免疫功能異常的持續(xù)存在會(huì)對(duì)心肌進(jìn)行不斷的損傷，使得疾病持續(xù)進(jìn)展。胸腺五肽是人工合成的五肽，具有與胸腺生成素相似的生物活性，對(duì)機(jī)體的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)探討胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾對(duì)自身免疫性DCM大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的干預(yù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及制劑：實(shí)驗(yàn)起止時(shí)間為 2009-11 至2011-12。 無(wú) 特 定 病 原 體 級(jí) Lewis 大 鼠 [北 京 維 通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(京 )2006-009]，6 周齡，體重 200～250g，雄性，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部 SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 [動(dòng)物飼養(yǎng)合格證編號(hào)：SYXK(遼 )2008-0005]。純化的豬心肌球蛋白和弗氏完全佐劑均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。

自身免疫性 DCM 大鼠模型的建立及分組：按操作程序成功建立自身免疫性 DCM 大鼠模型[1，2]，免 疫 28 天 后[3，4]， 將 存 活 的 45 只 Lweis 大 鼠 區(qū) 組隨機(jī)分為 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組（n=15）：即生理鹽水組：給適量生理鹽水；比索洛爾治療組：給富馬酸比索洛爾（6.65mg/kg，日 1 次，灌胃）治療；胸腺五肽聯(lián)合富馬酸比索洛爾治療組（聯(lián)合治療組）：給胸腺五肽（0.14 mg/kg，日 1 次，腹腔注射 ）聯(lián)合富馬酸比索洛爾（6.65 mg/kg，日 1 次，灌胃 ）。另取同齡 Lewis 大鼠作為空白對(duì)照組（n=15）。

標(biāo)本的采集和處理：用藥28天后各組大鼠均隨機(jī)取10只進(jìn)行心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)檢查。檢查完畢后，股靜脈注入 2～3 ml 10% 氯化鉀，使心室停搏于舒張期，迅速下腔靜脈取血，一部分血用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，一部分血離心（3000 轉(zhuǎn) / min，10 min），收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。取血后迅速開胸切取心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗后，去除心房、大血管及心臟外結(jié)締組織等，無(wú)菌紗布吸干水分，用于行心臟重塑指標(biāo)檢查。

T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)：取外周血 2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成 4ml，混勻。將稀釋后的血液沿試管壁徐徐加入 4ml淋巴細(xì)胞分離液Ficoll到液面之上。離心 2000 r/min，30 min，室溫18～20℃，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4層，上層為血漿層，第二層為分離液層（單個(gè)核細(xì)胞處于血漿層和分離液層中間），第三層為粒細(xì)胞層，底層為紅細(xì)胞層。用吸管將上二層間的單個(gè)核細(xì)胞層吸出收集到另一試管，用生理鹽水洗2遍，每次均以 1500 r/min，離心 10 min，棄上清后即可得到高純度的單個(gè)核細(xì)胞懸液。加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗大鼠簇分化抗原（CD）4、多甲藻黃素葉綠素蛋白標(biāo)記的抗大鼠 CD8、異硫氰酸熒光素 標(biāo)記的抗大鼠 CD3，室溫孵育 30 min 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：大鼠術(shù)前稱重并麻醉（戊巴比妥鈉 20～35 mg/kg）。麻醉完全后，將大鼠胸前及大腿內(nèi)側(cè)去毛，應(yīng)用 Agilent sonos 5500 超聲檢測(cè)儀，采用 11 - 3L 探頭，經(jīng)胸進(jìn)行心臟超聲檢查，在左心室腱索中部水平獲得清晰的 M - 型超聲圖像，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（ LVIDd ）、左心室收縮末期內(nèi)徑（ LVISd）、室間隔厚度、左心室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)（EF）。心臟彩超檢查完畢后，將大鼠仰面固定，剪開頸部皮膚，止血鉗頓性分離頸部皮膚，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，穿刺插入 20 G 靜脈小鞘管，經(jīng)壓力換能器連接至正華 MD 3000生物信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄大鼠 中心靜脈壓 ( CVP)、平均血壓、左心室舒張期末壓 (LVEDP) 、等容期內(nèi)左心室壓力最大變化速率 ( ±dp /dt) 。

心臟重塑指標(biāo)的測(cè)定：將切取的心臟用電子天平（精確到 0.001 g）稱取心臟重量（HW）。用直接測(cè)量法測(cè)量左心室長(zhǎng)軸長(zhǎng)度（L），左心室短軸長(zhǎng)度（D），兩者之比為球形指數(shù)。將心肌組織于 4% 多聚甲醛溶液中固定保存 24h 后，經(jīng)石蠟包埋，每個(gè)大鼠按順序取第二張 5μm 石蠟切片， 蘇木素 - 伊紅染色法過(guò)程染色，在放大10倍下獲取包括整個(gè)左心室截面的切片圖像，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張切片上左心室截面最長(zhǎng)徑（Dmax）及最短徑（Dmin），計(jì)算左心室截面直徑=（左心室截面最長(zhǎng)徑×左心室截面最短徑 ）1/2。

血清細(xì)胞因子水平的檢查： -20℃取出血清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清白介素 -10 及干擾素 -г 的含量，操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)量資料采用x±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，單因素兩組以上的均數(shù)間差異比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的比較：治療28 天后， 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，CD4 、CD4/ CD8比值均增高，CD8下降。聯(lián)合治療組與生理鹽水組和比索洛爾組相比， CD4 及 CD4/CD8 比值均降低，CD8增多。上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1

表1 各組 T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果和血清細(xì)胞因子水平的比較

表1 各組 T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果和血清細(xì)胞因子水平的比較

注：與空白對(duì)照組比較：*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ；與生理鹽水組比較：?P ＜0.05 ??P ＜ 0.01；與比索洛爾組比較：▲P ＜ 0.05▲▲P ＜ 0.01。 CD：簇分化抗原

組別 空白對(duì)照組 生理鹽水組 比索洛爾治療組 聯(lián)合治療組T淋巴細(xì)胞亞群C D 4（%） 4 0 . 1 2 ± 2 . 9 3 4 4 . 7 1 ± 0 . 3 1* 4 3 . 9 8 ± 0 . 6 5* 4 1 . 9 8 ± 2 . 3 4*?▲C D 8（%） 1 9 . 7 8 ± 3 . 7 4 1 6 . 7 6 ± 3 . 9 8* 1 7 . 1 4 ± 0 . 1 6* 1 8 . 2 7 ± 1 . 3 3*?▲C D 4 / C D 8 2 . 0 2 ± 0 . 0 5 2 . 6 9 ± 0 . 2 1* 2 . 6 0 ± 0 . 1 3* 2 . 0 9 ± 0 . 1 4*?▲干擾素 -г ( n g / L ) 1 . 8 9 ± 0 . 0 3 1 5 . 8 9 ± 0 . 3 0** 1 3 . 7 4 ± 0 . 1 9** 6 . 9 3 ± 0 . 0 6**??▲▲血清白介素 -1 0 ( n g / L ) 1 . 6 8 ± 0 . 1 1 5 . 9 3 ± 0 . 2 8** 6 . 3 2 ± 0 . 0 7** 1 1 . 3 1 ± 0 . 5 8**??▲▲

各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)的比較：治療28天后，生理鹽水組和比索洛爾組與空白對(duì)照組相比，左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑均增大，室間隔厚度、左心室后壁厚度均縮小 ，生理鹽水組射血分?jǐn)?shù)降低。比索洛爾治療組與生理鹽水組相比，左心室收縮末期內(nèi)徑縮小，射血分?jǐn)?shù)升高。聯(lián)合治療組與生理鹽水組和比索洛爾組相比，左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑均縮小，室間隔厚度、左心室后壁厚度均增大。聯(lián)合治療組較生理鹽水組的射血分?jǐn)?shù)升高。上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。表2

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)、血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)及心臟重塑指標(biāo)的比較 （n=10，±s）

各組血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的比較：治療 28天后，生理鹽水組、比索洛爾組與空白對(duì)照組比較，心臟重量 /體重、中心靜脈壓水平及 LVEDP 均顯著升高，平均血壓和等容期內(nèi)左心室壓力最大變化速率均顯著降低。與生理鹽水組比較，比索洛爾組中心靜脈壓水平及 LVEDP 降低。聯(lián)合治療組與生理鹽水組和比索洛爾組比較，心臟重量/體重、中心靜脈壓水平及 LVEDP均降低，平均血壓和等容期內(nèi)左心室壓力最大變化速率均升高。上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05～0.01）。 表2

各組大鼠心臟重塑指標(biāo)的比較：治療 28天后，生理鹽水組和比索洛爾組與空白對(duì)照組相比，左心室長(zhǎng)軸、左心室短軸及左心室截面直徑均增大，球形指數(shù)減小。聯(lián)合治療組與生理鹽水組和比索洛爾組相比，左心室長(zhǎng)軸、左心室短軸及左心室截面直徑均減小，球形指數(shù)增加。比索洛爾組與生理鹽水組比較，左心室截面直徑減小。上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表2

各組血清細(xì)胞因子水平的比較：治療 28 天后，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，白介素 -10 及干擾素 -г 均顯著增高（P＜0.01）。 聯(lián)合治療組與生理鹽水組和比索洛爾組比較，血清白介素 -10 水平增高，干擾素-г水平均降低。上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表1

各組大鼠心臟病理組織學(xué)的測(cè)定結(jié)果：空白對(duì)照組大鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌細(xì)胞壞死；生理鹽水組大鼠心肌 HE染色，心肌組織出現(xiàn)廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及多核巨細(xì)胞，肌纖維排列紊亂，肌漿溶解，伴有心肌壞死區(qū)域。比索洛爾治療組與聯(lián)合治療組大鼠心肌的上述觀察指標(biāo)數(shù)量減少，程度降低。圖1

圖1 各組大鼠心臟病理組織學(xué)的測(cè)定結(jié)果 （n=10 ） HE 染色 × 20 1A：對(duì)照組 1B：生理鹽水組 1C：比索洛爾治療組 1D：聯(lián)合治療組

3 討論

DCM 的 發(fā) 病 與 免 疫 系 統(tǒng) 狀 態(tài) 異 常 有 關(guān)[5，6]，因此，從發(fā)病機(jī)制角度出發(fā)，調(diào)節(jié)免疫功能應(yīng)該有益于心功能的改善。本研究發(fā)現(xiàn)，胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾治療后，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)較單用比索洛爾治療改善更加明顯，表現(xiàn)為左心室內(nèi)徑減小，室壁厚度增加，球形指數(shù)及射血分?jǐn)?shù)提高，以及血流動(dòng)力學(xué)改善。說(shuō)明胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾較單用比索洛爾治療能更明顯的改善 DCM 大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能。

CD4+T/ CD8+T 是 T 細(xì) 胞 的 主 要 表 面 標(biāo) 志，表達(dá) CD4+ 的主要是輔助性 T 細(xì)胞（Th），表達(dá)CD8 的主要是細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（CTL）。目前認(rèn)為，CD4+ T 細(xì)胞是啟動(dòng)心肌炎必需的，而且被認(rèn)為是疾 病 進(jìn)展的 標(biāo) 志[7]。Th 根據(jù) 其 所分 泌 的細(xì) 胞 因子及功能的不同劃分為三種亞群：Th0、Th1、Th2。Th1 主要表達(dá)白介素 -2 和干擾素 -г，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2 主要表達(dá)白介素 -4、白介素 -6 和白介素 -10，輔助體液免疫。白介素 -10 是已知的具有抗炎、抑制免疫活性的 II型細(xì)胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)，白介素 -10 的表達(dá)能夠顯著減少心肌炎癥及 纖 維 化， 并 且增 加 射 血分 數(shù)[8]；Th0 可在 不 同的信號(hào)刺激下分化為 Th1 或 Th2。當(dāng) Th1、Th2 失平衡時(shí)，意味著免疫自穩(wěn)狀態(tài)被破壞，而通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子干擾素 -г、白介素 -10 水平，可以反映Th1、Th2 的平衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)顯示與空白對(duì)照組相比，生理鹽水組的白介素 -10 及干擾素 -г 均顯著增高，CD4 及 CD4/CD8 顯著升高，CD8 顯著降低，提示 DCM 大鼠存在免疫失衡狀態(tài)。治療后，與生理鹽水組相比，聯(lián)合治療組的血清干擾素-г水平顯著降低，白介素 -10 水平顯著增高，同時(shí)CD4/CD8 趨于正?；?，表明胸腺五肽可逆轉(zhuǎn) Th1、Th2 失衡，調(diào)整免疫狀態(tài)，從而抑制對(duì)心肌的損害。其可能的機(jī)制是通過(guò)抑制 Th1 細(xì)胞增殖、抑制 Th1分泌的炎性細(xì)胞因子、促使 Th2 活化和誘導(dǎo) Th2分泌抗炎性細(xì)胞因子，從而減少 Th1 類細(xì)胞因子的分泌，刺激 Th2 類細(xì)胞因子的產(chǎn)生。該研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告是一致的[9]。

[1]Kodama M，Matsumoto Y，F(xiàn)ujiwara M，et al. A novel experimental model of giant cell myocarditis induced in rats by immuniazation with cardiac myosin fraction.Clin Immunol Immunopathol,1990，57:250-262.

[2]Inomata T，Hanawa H，Miyanishi T，et al.Localization of porcine cardiac myosin epitopes that induce experimental autoimmune myocarditis.Circ Res，1995，76:726-733.

[3]Gavrilova SA，Morozova MP，Kniazhentseva AK，et al. Dynamics of autoimmune myocarditis development in rats. Izv Akad Nauk Ser Biol，2010， 597-609.

[4]Cunningham MW.Cardiac myosin andthe TH1/TH2 paradigm in autoimmune myocarditis. Am J Pathol, 2001，159:5-12.

[5]秦玲，井玲，鄭楊 .擴(kuò)張型心肌病與免疫因素關(guān)系的研究 .中國(guó)循環(huán)雜志，2001,16:193-194.

[6]丁建東，吳翔，顧勇 .抗人心肌線粒體抗體在病毒性心肌炎和擴(kuò)張型心肌病中的檢測(cè)及其意義 . 中國(guó)循環(huán)雜志，2001,16:38-40.

[7]Haasken S，Auger JL，Binstadt BA. Absence of β2 integrins impairs regulatory T cells and exacerbates CD4+ T cell-dependent autoimmune carditis. J Immunol，2011，187:2702-2710.

[8]Kaya Z， Leib C， Werfe S，et al. Comparison of IL-10 and MCP-1-7ND gene transfer with AAV9 vectors for protection from murine autoimmune myocarditis. Cardiovascular Res，2011，9:116-123.

[9]Liu W，Li WM， Gao C，et al.Effects of atorvastatin on the Th1/Th2 Polarization of ongoing experimental autoimmune myocarditis in Lewis rats.J Autoimmun， 2005，25:258-263.

The Interventional Effect of Thymopentin Combining With Bisoprolol in Dilated Cardiomyopathy Rats With Immune-Induction

LI Peng, JIA Zhi-mei, MA Chun-yan, XIE Cheng-yao, LIU Jun, JIA Zhi-jun.

Department of Cardiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang (110001), Liaoning, China

Corresponding Author: JIA Zhi-mei, Email: jia20060101@sogou.com

Objective: To observe the interventional effect of thymopentin combining with bisoprolol on cardiac structure and function in dilated cardiomyopath (DCM) rats with immune-induction.Methods: A total of 45 DCM rats with immune-induction model were divided into 3 groups, Experimental control group, the rats were treated with normal saline, Bisoprolol group, and Thymopentin with bisoprolol group, n=15 in each group. In addition, there was a Blank control group with 15 normal rats. All animals were treated for 28 days. The T-lymphocyte subsets, cardiac echocardiography, ventricular remodeling index and the serum levels of cytokine were examined in 10 randomly selected rats from each group and compared among different groups.Results: Compared with Experimental control group and Bisoprolol group, the Thymopentin with bisoprolol group showed decreased serum level of CD4/CD8 and increased CD8; decreased left ventricular end-diastolic dimension (LVEDD) and LVESD, increased thickness of ventricular septal; decreased cardiac weight/body weight, central vein pressure and LVED pressure; reduced left ventricular long-axis, minor-axis and cross section diameter, enlarged left ventricular spherical index; the increased serum level of IL-10 and decreased IFN-г; P＜0.05～0.01 respectively.Conclusion: In DCM rats with immune-dysfunction, the treatment of thymopentin combining with bisoprolol could improve the left ventricular remodeling and function, the effect was superior to bisoprolol alone. The mechanism of thymopentin might be because of inducing and promoting T-lymphocyte’s differentiation, maturation and activation.

Dilated Cardiomyopathy; T-lymphocyte subsets; Thymopentin; Bisoprolol (Chinese Circulation Journal, 2013,28: 230.)

2012-06-25）

(助理編輯：曹洪紅)

*

遼寧省教育廳 2009 年度高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（2009A740）

110001 遼寧省沈陽(yáng)市，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科（李鵬、賈志梅 ），超聲科（馬春燕 ）;中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理教研室

（謝成耀 ）,免疫教研室（劉軍 ）;廣西南寧武鳴縣人民醫(yī)院 急診科（賈志軍 ）

李鵬 碩士研究生 主要從事冠心病與心力衰竭的研究 Email:skywalker1986@163.com 通訊作者 :賈志梅 Email:jia20060101@sogou.com

R541

A

1000-3614（2013）03-0230-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.020

方法：以純化的豬心肌球蛋白與弗式完全佐劑乳化后的混合液皮下免疫 Lewis 大鼠建立自身免疫性 DCM 模型，45 只 DCM 大鼠，隨機(jī)分為 3 組（每組n=15）：生理鹽水組、比索洛爾治療組及胸腺五肽聯(lián)合富馬酸比索洛爾治療組（聯(lián)合治療組 ），另選同齡 Lewis 大鼠作為空白對(duì)照組（n=15）。用藥 28 天后各組大鼠均隨機(jī)取 10 只進(jìn)行 T 淋巴細(xì)胞亞群、心臟超聲、心臟重塑指標(biāo)、血流動(dòng)力學(xué)及血清細(xì)胞因子水平的檢查。

結(jié)果：28 天治療后，與生理鹽水組和比索洛爾治療組比較：聯(lián)合治療組簇分化抗原（CD）4 和 CD4/CD8 比值降低 ，CD8 增加；左心室舒張末期內(nèi)徑和左心室收縮末期內(nèi)徑均縮小，室間隔厚度和左心室后壁厚度均增大；心臟重量 /體重、中心靜脈壓水平及左心室舒張期末壓均降低，平均血壓及等容期內(nèi)左心室壓力最大變化速率均升高；左心室長(zhǎng)軸、左心室短軸及左心室截面直徑均減小，球形指數(shù)增大；血清白介素 -10 水平增高，干擾素 -г 水平降低，上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05～0.01）。

結(jié)論：DCM 大鼠存在免疫功能紊亂；胸腺五肽聯(lián)合比索洛爾改善 DCM 大鼠左心室重構(gòu)和功能的作用優(yōu)于比索洛爾單藥治療；胸腺五肽的作用機(jī)制可能為誘導(dǎo)和促進(jìn)T淋巴細(xì)胞及其亞群的分化、成熟和活化。