結(jié)核分枝桿菌(MTB)異質(zhì)性耐藥研究進(jìn)展

柳清云 孫 剛 高 謙

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究院 醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

20世紀(jì)40年代以來(lái)，鏈霉素、異煙肼、利福平等抗結(jié)核藥物的廣泛使用，使結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率一度大幅下降［1］。但由于耐藥結(jié)核，特別是耐多藥結(jié)核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(extensivelydrug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的出現(xiàn)，給結(jié)核病的防控帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，2011年全球約有31萬(wàn)MDR-TB，其中約9%為XDR-TB，中國(guó)是全世界結(jié)核病第二高負(fù)擔(dān)國(guó)家，MDR-TB病例數(shù)居世界首位［2］。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)主要通過藥物結(jié)合位點(diǎn)或藥物活化基因等特定基因組區(qū)域的突變獲得可穩(wěn)定遺傳的耐藥基因型。例如，利福平耐藥性是由于RNA聚合酶β亞基編碼基因(rpoB)耐藥決定區(qū)的點(diǎn)突變引起［3］，異煙肼耐藥性主要由過氧化氫-過氧化物酶編碼基因(katG)的突變導(dǎo)致［4］。通過檢測(cè)這些基因的耐藥相關(guān)突變，可以預(yù)測(cè)MTB的耐藥情況。在檢測(cè)臨床分離培養(yǎng)的樣本時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)敏感菌株和耐藥菌株共存的現(xiàn)象，即異質(zhì)性耐藥［5］。異質(zhì)性耐藥因?yàn)橛绊懰幟艚Y(jié)果以及治療方案的正確判斷和評(píng)估而逐漸受到人們的重視。本文將對(duì)目前結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的產(chǎn)生及其對(duì)臨床的影響進(jìn)行綜述。

異質(zhì)性耐藥的產(chǎn)生 早在抗結(jié)核藥應(yīng)用之初，研究者就發(fā)現(xiàn)MTB存在異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象。由于MTB存在自發(fā)突變，即使是對(duì)藥物敏感的MTB群體中也含有低頻率(10－9～10－8)的耐藥菌［6］，但此時(shí)耐藥菌的頻率過低無(wú)法檢測(cè)，沒有臨床意義。抗結(jié)核治療開始后，MTB群體中的敏感菌被逐漸殺死，耐藥菌的頻率逐漸上升，當(dāng)達(dá)到臨界值即被診斷為耐藥結(jié)核病。由此可見，異質(zhì)性耐藥反映了MTB群體從部分耐藥向全部耐藥轉(zhuǎn)變的中間過程，耐藥性的定義也取決于耐藥菌在樣本中被檢測(cè)到的頻率。由于藥敏測(cè)試方法的不同，其檢測(cè)靈敏度也各不相同。Canetti等［7］于1969年總結(jié)了當(dāng)時(shí)3種主流的藥敏測(cè)試方法(絕對(duì)濃度法、耐藥-比率法和比例法)的靈敏度、特異性和操作難易度等特點(diǎn)，建議以比例法作為MTB藥敏測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)。WHO的結(jié)核病指南采納了這一建議，規(guī)定當(dāng)耐藥菌的頻率高于1%時(shí)(這一數(shù)值遠(yuǎn)高于MTB的自發(fā)突變頻率)，即可診斷為有臨床意義的耐藥結(jié)核病［8］。這種以細(xì)菌在含藥培養(yǎng)基中是否生長(zhǎng)作為判斷耐藥標(biāo)準(zhǔn)的方法稱為表型耐藥檢測(cè)，是目前耐藥檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

隨著對(duì)MTB耐藥機(jī)制的深入了解，通過檢測(cè)耐藥相關(guān)突變可以預(yù)測(cè)細(xì)菌的耐藥性，即基因型耐藥。在臨床檢測(cè)中，常會(huì)出現(xiàn)基因型耐藥和表型耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致或從同一樣本中同時(shí)檢出耐藥基因型和敏感基因型的現(xiàn)象，提示異質(zhì)性耐藥的存在對(duì)基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果有影響［5，9］。Rinder等［5］用 PCR和克隆方法對(duì)臨床MTB異質(zhì)性耐藥進(jìn)行了評(píng)估，通過檢測(cè)異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇3種藥物的耐藥相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)分別有5/16、3/17、1/20的臨床樣本中同時(shí)存在攜帶耐藥突變和沒有耐藥突變的MTB。Tolani等［10］用 GenoType MTBDRplus檢測(cè)發(fā)現(xiàn)利福平耐藥菌株中rpoB耐藥異質(zhì)性達(dá)34%(22/64)，異煙肼耐藥菌中異質(zhì)性耐藥更高達(dá)65．7%(23/35)。此外，二線抗結(jié)核藥物的耐藥菌株中也存在異質(zhì)性耐藥。Chakravorty等［11］用分子信標(biāo)檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)韓國(guó)19．0%(8/42)的喹諾酮耐藥為異質(zhì)性耐藥。Zhang等［12］用PCR擴(kuò)增克隆并測(cè)序DNA旋轉(zhuǎn)酶α亞基(gyrA)基因耐藥決定區(qū)發(fā)現(xiàn)23%(54/235)的喹諾酮耐藥菌株為異質(zhì)性耐藥。Streicher等［13］對(duì)氧氟沙星和阿米卡星耐藥耐藥基因作直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥在兩種耐藥菌中的比例分別為25%和 16．3%。

異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象促使人們研究耐藥MTB的產(chǎn)生和發(fā)展過程。MTB耐藥突變數(shù)據(jù)庫(kù)(TBDReaMDB)的記錄顯示與同一種藥物耐藥相關(guān)的突變通常有多種甚至數(shù)十種［14］，而在臨床檢測(cè)中只發(fā)現(xiàn)其中的一至兩種。由此引出的問題是，這些突變是如何在細(xì)菌群體中被篩選出來(lái)的?通過對(duì)同一患者連續(xù)采樣，Mariam等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在患者治療過程中，MTB群體對(duì)鏈霉素先后產(chǎn)生了4種不同的耐藥相關(guān)突變(編碼30S核糖體蛋白的基因rpsL的K87R和K42R突變，16S核糖體RNA rrsA513C和A1400G突變)，但在治療后期只有突變r(jià)psL K42R在群體中被固定下來(lái)。本課題組Sun等［16］在近期的研究中用高通量測(cè)序技術(shù)更細(xì)致地研究了3例結(jié)核患者體內(nèi)MTB異質(zhì)性耐藥的發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)在異煙肼耐藥性產(chǎn)生的早期，同一細(xì)菌群體中存在4～5種與異煙肼耐藥相關(guān)的突變(katG V1A，D94N和S315R突變，inhA的C-15T)，這些突變的頻率之和接近100%，說(shuō)明突變分布在不同的結(jié)核菌亞群中，幾乎沒有敏感菌存在。隨著治療進(jìn)行，最終只有1種耐藥突變的細(xì)菌亞群(katG D94N)的頻率上升至主導(dǎo)地位(93．9%)，其他細(xì)菌亞群則逐漸消失，這提示攜帶不同突變的耐藥菌亞群之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)并最后篩選出優(yōu)勢(shì)亞群。這種亞群間的相互競(jìng)爭(zhēng)，又被稱為克隆干擾，其結(jié)果使適應(yīng)性最強(qiáng)的耐藥結(jié)核菌脫穎而出［17］。

克隆干擾在亞群競(jìng)爭(zhēng)中篩選出適應(yīng)性較強(qiáng)的菌株，而適應(yīng)性強(qiáng)的菌株可能通過兩種方式獲得，一種是不同耐藥突變本身對(duì)細(xì)菌的適應(yīng)性強(qiáng)弱存在差異［18］;另一種是細(xì)菌通過額外的基因組的突變補(bǔ)償了由于耐藥突變?cè)斐傻倪m應(yīng)性下降，這種現(xiàn)象稱為補(bǔ)償性突變。Comas等［19］研究證實(shí)，MTB rpoA及rpoC基因上的特定突變補(bǔ)償了利福平耐藥突變帶來(lái)的適應(yīng)性下降。我們課題組也發(fā)現(xiàn)，耐藥突變出現(xiàn)之后，另有11個(gè)非同義突變?cè)谥委熯^程中發(fā)生顯著性變化，其中的6個(gè)突變頻率在80%以上。這些突變所在的基因大多與細(xì)胞壁合成或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，提示可能與耐藥MTB的補(bǔ)償性機(jī)制相關(guān)［16］。

異質(zhì)性耐藥對(duì)臨床耐藥檢測(cè)的影響 目前，用于檢測(cè)耐藥結(jié)核病的分子診斷技術(shù)主要有Xpert MTB/RIF、GenoType MTBDRplus、Sloppy Molecular Beacon、Sanger測(cè)序等［11，20－21］。這些技術(shù)能夠快速檢測(cè)臨床樣本中的耐藥突變，但對(duì)異質(zhì)性耐藥樣本中耐藥突變的檢測(cè)靈敏度尚不能令人滿意［22－23］。Chakravorty 等［11，24］開 發(fā) 的 Sloppy Molecular Beacon方法可以檢測(cè)樣本中比例在40%以上的利福平耐藥突變和比例高于20%的喹諾酮耐藥突變。Sanger測(cè)序可以檢測(cè)出20%以上的耐藥突變［5］。由此可見，分子診斷技術(shù)目前還難以達(dá)到表型耐藥檢測(cè)方法對(duì)異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)靈敏度。

對(duì)異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)靈敏度低將影響分子診斷技術(shù)對(duì)耐藥結(jié)核病的預(yù)測(cè)率。在全球范圍內(nèi)，不同地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室都存在基因型耐藥和表型耐藥檢測(cè)結(jié)果不符的現(xiàn)象，且對(duì)同種藥物耐藥預(yù)測(cè)率差異較大［25－26］。為了驗(yàn)證了異質(zhì)性耐藥對(duì)分子診斷技術(shù)預(yù)測(cè)率的影響，Streicher等［13］對(duì)171株氧氟沙星耐藥以及140株阿米卡星耐藥的樣本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)分別有9和11個(gè)樣本的基因型耐藥與表型耐藥檢測(cè)結(jié)果不符，即在表型耐藥的菌株中未檢測(cè)到耐藥突變。但通過對(duì)耐藥菌株的耐藥相關(guān)基因克隆并測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，其中7/9喹諾酮耐藥樣本以及11/11阿米卡星耐藥樣本都能檢測(cè)出gyrA或rrs突變。將這些異質(zhì)性耐藥菌株納入考慮，該研究中耐藥基因型對(duì)耐藥表型的預(yù)測(cè)率將分別達(dá)到98．8%和100%。

當(dāng)然，除異質(zhì)性耐藥影響耐藥基因型對(duì)耐藥表型的預(yù)測(cè)外，其他的因素還包括:(1)未知或其他耐藥機(jī)制導(dǎo)致MTB耐藥，Takiff等［27］發(fā)現(xiàn)外排泵系統(tǒng)可介導(dǎo)喹諾酮低濃度耐藥，Zaunbrecher等［28］也發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因(eis)啟動(dòng)子區(qū)的特定突變可導(dǎo)致卡那霉素低濃度耐藥;(2)體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致耐藥菌亞群比例下降，低于其檢測(cè)靈敏度，Martin等［29］發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)速率快的群體會(huì)掩蓋生長(zhǎng)速率慢的群體，由于MTB耐藥性的產(chǎn)生通常伴隨著生長(zhǎng)速率的下降，體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致其在群體中的比例變小或者消失。

研究異質(zhì)性耐藥的意義 研究異質(zhì)性耐藥，首先加深了對(duì)耐藥結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)。耐藥MTB的成功建立，需要MTB在自身群體達(dá)到相當(dāng)數(shù)量，發(fā)生多種不同突變形式(包括多種耐藥突變)來(lái)應(yīng)對(duì)抗生素壓力，并以相互競(jìng)爭(zhēng)的方式選出適應(yīng)性最好的攜帶耐藥突變的耐藥細(xì)菌亞群［16］。這一過程中決定耐藥突變種類的因素包括MTB在體內(nèi)的復(fù)制時(shí)間，突變速率以及群體數(shù)量。由于細(xì)菌群體數(shù)量是決定自發(fā)突變數(shù)量的關(guān)鍵因素，因此在細(xì)菌群體數(shù)量較小的時(shí)候用藥治療，可以有效地降低耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，這為早期診斷技術(shù)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)［30］。目前臨床普遍采用的結(jié)核病診斷方法為顯微鏡檢測(cè)，其檢測(cè)的靈敏度需要在每毫升痰液中有10 000個(gè)細(xì)菌，而采用新的液體培養(yǎng)或GeneXpert分子檢測(cè)靈敏度可以到達(dá)每毫升痰液10～100個(gè)細(xì)菌，靈敏度提高了100～1 000倍［22］。因此，普及靈敏的早期診斷技術(shù)，有利于在體內(nèi)菌載量較小的時(shí)候及早治療，這對(duì)于減少耐藥菌株的產(chǎn)生，特別是減少適應(yīng)性高的耐藥菌的產(chǎn)生具有重要意義。

其次，檢測(cè)異質(zhì)性耐藥對(duì)評(píng)估結(jié)核病治療方案和指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。由于異質(zhì)性耐藥的原因，在低頻率的耐藥菌株存在時(shí)藥敏結(jié)果為敏感，而針對(duì)敏感菌株的治療方案最后可能由于耐藥菌株的比例逐漸增加而治療失敗。而目前對(duì)MTB異質(zhì)性耐藥的認(rèn)識(shí)還不深入，針對(duì)異質(zhì)性耐藥是否需要采取不同的治療措施還有待探討。在腫瘤治療中，異質(zhì)性的出現(xiàn)使抗腫瘤藥物只能殺傷部分腫瘤細(xì)胞，而小部分存活下來(lái)的耐藥腫瘤細(xì)胞則逐漸占據(jù)主體地位［31］。針對(duì)腫瘤的異質(zhì)性耐藥，目前主要采取增加藥物劑量、靶向給藥等方案進(jìn)行特殊化治療［32－33］。這些在腫瘤治療領(lǐng)域的研究經(jīng)驗(yàn)?zāi)芊裨诮Y(jié)核病異質(zhì)性耐藥的治療中得到借鑒，有待進(jìn)一步的研究。

［1］ Mitchison DA．The diagnosis and therapy of tuberculosis during the past 100 years［J］．Am J Respir Crit Care Med，2005，171(7):699 －706．

［2］ World Health Organization．Global Tuberculosis Report 2012［M］．World Health Organization，2012:1 －2．

［3］ Telenti A，Imboden P，Marchesi F，et al．Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis［J］．Lancet，1993，341(8846):647 － 650．

［4］ Zhang Y，Heym B，Allen B，et al．The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis［J］．Nature，1992，358(6387):591 －593．

［5］ Rinder H，MieskesKT，LoscherT．Heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2001，5(4):339－345．

［6］ David HL．Probability distribution of drug-resistant mutants in unselected populations of Mycobacterium tuberculosis［J］．Appl Microbiol，1970，20(5):810 －814．

［7］ Canetti G，F(xiàn)oxW，KhomenkoA，etal．Advancesin techniques of testing mycobacterial drug sensitivity，and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programmes［J］．Bull World Health Organ，1969，41(1):21 －43．

［8］ World Health Organization．Guidelines for drug susceptibility testing for second-line anti-tuberculosis drugs for dots-plus［M］．World Health Organization，2001:1 －3．

［9］ Nikolayevskyy V，Balabanova Y，Simak T，et al．Performance of the Genotype MTBDRPlus assay in the diagnosis of tuberculosis and drug resistance in Samara，Russian Federation ［J］．BMC Clin Pathol，2009，9:2．

［10］ Tolani MP，D'Souza DT，Mistry NF．Drug resistance mutations and heteroresistance detected using the GenoType MTBDRplusassay and theirimplication fortreatment outcomes in patients from Mumbai，India ［J］．BMC Infect Dis，2012，12:9．

［11］ Chakravorty S，AladegbamiB，ThomsK，etal．Rapid detection offluoroquinolone-resistantand heteroresistant Mycobacterium tuberculosisby use ofsloppy molecular beacons and dual melting-temperature codes in a real-time PCR assay［J］．J Clin Microbiol，2011，49(3):932 －940．

［12］ Zhang X，Zhao B，Liu L，et al．Subpopulation analysis of heteroresistance to fluoroquinolone in Mycobacterium tuberculosis isolates from Beijing，China ［J］．J Clin Microbiol，2012，50(4):1471 －1474．

［13］ Streicher EM，Bergval I，Dheda K，et al．Mycobacterium tuberculosis population structure determines the outcome of genetics-based second-line drug resistance testing ［J］．Antimicrob Agents Chemother，2012，56(5):2420 －2427．

［14］ Sandgren A，Strong M，Muthukrishnan P，et al．Tuberculosis drug resistance mutation database ［J］．PLoS Med，2009，6(2):e2．

［15］ Mariam SH，Werngren J，Aronsson J，et al．Dynamics of antibiotic resistant Mycobacterium tuberculosis during longterm infection and antibiotic treatment［J］．PLoS One，2011，6(6):e21147．

［16］ Sun G，Luo T，Yang C，et al．Dynamic population changes in Mycobacterium tuberculosis during acquisition and fixation of drug resistance in patients［J］．J Infect Dis，2012，206(11):1724－1733．

［17］ Muller HJ．Some genetic aspects of sex ［J］．The American Naturalist，1932，66(703):118 －138．

［18］ Didelot G，Molinari F，Tchenio P，et al．Tequila，a neurotrypsin ortholog，regulates long-term memory formation in Drosophila［J］．Science，2006，313(5788):851 －853．

［19］ Comas I，BorrellS，RoetzerA，etal．Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerase genes［J］．Nat Genet，2012，44(1):106 －110．

［20］ Hillemann D，Rusch-Gerdes S，Richter E．Evaluation of the GenoType MTBDRplus assay for rifampin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens［J］．J Clin Microbiol，2007，45(8):2635－2640．

［21］ Boehme CC，Nicol MP，Nabeta P，et al．Feasibility，diagnostic accuracy，and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance:a multicentre implementation study ［J］．Lancet，2011，377(9776):1495 －1505．

［22］ Blakemore R，Story E，Helb D，et al．Evaluation of the analytical performance of the Xpert MTB/RIF assay［J］．J Clin Microbiol，2010，48(7):2495-2501．

［23］ Mironova S，Pimkina E，Kontsevaya I，et al．Performance of the GenoTypeMTBDRPlusassayinroutinesettings:a multicenter study［J］．Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，31(7):1381－1387．

［24］ Chakravorty S，Kothari H，Aladegbami B，et al．Rapid，highthroughput detection of rifampin resistance and heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis by use of sloppy molecular beacon melting temperature coding ［J］．J Clin Microbiol，2012，50(7):2194 －2202．

［25］ Maruri F，Sterling TR，Kaiga AW，et al．A systematic review of gyrase mutations associated with fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis and a proposed gyrase numbering system ［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67(4):819－831．

［26］ Georghiou SB，Magana M，Garfein RS，et al．Evaluation of genetic mutations associated with Mycobacterium tuberculosis resistancetoamikacin，kanamycin and capreomycin:a systematic review ［J］．PLoS One，2012，7(3):e33275．

［27］ Takiff HE，Cimino M，Musso MC，et al．Efflux pump of the proton antiporter family confers low-level fluoroquinolone resistance in Mycobacterium smegmatis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93(1):362 －366．

［28］ Zaunbrecher MA，SikesRD Jr．，Metchock B，etal．Overexpression of the chromosomally encoded aminoglycoside acetyltransferase eis confers kanamycin resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(47):20004 －20009．

［29］ Martin A，Herranz M，Ruiz Serrano MJ，et al．The clonal composition of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens could be modified by culture［J］．Tuberculosis(Edinb)，2010，90(3):201 －207．

［30］ Fortune SM．The surprising diversity ofMycobacterium tuberculosis:change you can believe in ［J］．J Infect Dis，2012，206(11):1642 －1644．

［31］ Marusyk A， Almendro V， Polyak K．Intra-tumour heterogeneity:a looking glass for cancer?［J］．Nat Rev Cancer，2012，12(5):323 －334．

［32］ Samuel N，Hudson TJ．Translating genomics to the clinic:implications of cancer heterogeneity ［J］．Clin Chem，2012，PMID:23151419［Epub ahead of print］．

［33］ Richardson ME，Siemann DW．Tumor cell heterogeneity:impact on mechanisms of therapeutic drug resistance［J］．Int J Radiat Oncol Biol Phys，1997，39(4):789 －795．