六味地黃湯對(duì)5/6腎切除大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

隆獻(xiàn)　何澤云　周艷利　羅寅亮　李巖巖　徐文峰　李旭華

腎間質(zhì)纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)過量積聚、腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞及功能喪失為特征，是多種慢性腎臟疾病走向腎功能衰竭的主要病理改變。其發(fā)病機(jī)制通常認(rèn)為與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及多種細(xì)胞因子的共同作用等有關(guān)。近年來HGF作為一種具有負(fù)性調(diào)控腎纖維化效應(yīng)的腎臟保護(hù)因子得到了廣泛關(guān)注[1]。

以往研究顯示，六味地黃丸能促進(jìn)5/6腎切除大鼠殘腎腎小球化生、延緩腎切除大鼠腎組織纖維化[2-3]，但其具體作用機(jī)制尚未得到完全闡明。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究HGF及其特異性受體c-Met在5/6腎切除大鼠模型殘腎的表達(dá)及六味地黃湯對(duì)其表達(dá)的影響，探討六味地黃湯抗腎纖維化的可能作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治腎間質(zhì)纖維化提供思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠40只，6～8周齡，重量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，批號(hào)：SCXK(湘)2009-0004。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)、恒溫，每日更換墊料，定期消毒籠具；每天給予12小時(shí)燈光照射。

1.1.2主要試劑兔抗大鼠HGF多克隆抗體(BAO911)，購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠c-Met多克隆抗體(BS-0668R)，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG多聚體(PV-9001)、DAB顯色劑試劑盒(AR1022)，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物六味地黃湯(熟地黃24 g、山茱萸12 g、山藥12 g、澤瀉9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g)購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，由課題組自行制備藥液。制備方法：先將藥材用相當(dāng)于藥材2倍的自來水浸泡2小時(shí)，武火煮沸后再文火煎熬30分鐘，過濾后收集煎液，原藥渣再加少量水煎煮，取二煎液。將兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮。濃縮藥液每毫升含生藥1 g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重從輕到重編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=15)和六味地黃湯組(n=15)。動(dòng)物適用性喂養(yǎng)一周后，模型組、六味地黃湯組均按照文獻(xiàn)[4]在無菌條件下行5/6腎切除手術(shù)。用10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，分離左腎，行上下極切除，1周后再次麻醉大鼠，切除右腎。假手術(shù)組同期行兩次手術(shù)，每次僅打開腹腔，暴露腎臟后關(guān)腹。第二次手術(shù)后7天，開始進(jìn)行干預(yù)。六味地黃湯組每天上午予六位地黃湯灌胃(大鼠用藥劑量=成人劑量mg/d×0.018/體重)計(jì)算[5]。假手術(shù)組、模型組均予等體積蒸餾水灌胃。共給藥8周。在造模過程及造模后一周內(nèi)，模型組3只大鼠、六味地黃湯組2只大鼠死亡。死亡原因有麻醉意外、術(shù)中大出血及術(shù)后感染等。予以剔除。模型組剩余大鼠12只，六味地黃湯組剩余大鼠13只。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取出大鼠殘腎組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，分別用于HE、Masson染色及免疫組化檢測(cè)。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目和方法

1.3.1組織學(xué)觀察取石蠟塊，4 μm切片后分別進(jìn)行HE及Masson染色。MOTIC光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SP法。取石蠟塊，4 μm切片，常規(guī)脫蠟至水。3% H2O2室溫孵化10分鐘，蒸餾水漂洗后，熱修復(fù)抗原，冷卻后用PBS液漂洗兩次。將切片放入濕盒中，每張切片分別滴加兔抗大鼠HGF多克隆抗體50 μl(1∶100稀釋)，37℃孵育2小時(shí)。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。PBS漂洗滴后滴加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體50 μl，室溫孵育20分鐘。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。c-Met染色步驟同HGF。用MOTIC多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。每例切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍不重疊視野，計(jì)算陽性染色面積與視野內(nèi)腎間質(zhì)總面積(去除腎小球)的比值并取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1腎組織光鏡檢查

2.1.1HE染色5/6腎切除大鼠殘腎組織HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠腎小球、腎小管和間質(zhì)形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；模型組腎小球系膜細(xì)胞增生，部分腎小球形成局灶性或迷漫性硬化，毛細(xì)血管絆擴(kuò)張，腎小囊擴(kuò)張，腎小囊壁層上皮細(xì)胞增生，腎小管發(fā)生代償性擴(kuò)張，可見蛋白管型，腎間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。與模型組相比，六味地黃湯組病理變化較輕，腎小球硬化、腎小管擴(kuò)張及間質(zhì)纖維化程度減輕。見圖1。

2.1.2Masson染色5/6腎切除大鼠殘腎組織Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎臟形態(tài)正常，腎間質(zhì)無明顯膠原纖維；模型組腎間質(zhì)及腎小球內(nèi)均可見大量染成藍(lán)色的膠原纖維；六味地黃丸組膠原纖維也明顯增生，但較模型組減輕。見圖2。

2.2六味地黃湯對(duì)5/6腎切除大鼠殘腎組織HGF蛋白和c-Met蛋白的影響

2.2.1HGF蛋白表達(dá)免疫組化HGF陽性表達(dá)為棕黃色顯色，主要表達(dá)于腎小球系膜、基底膜及腎小管上皮細(xì)胞的胞漿。假手術(shù)組可見有微量陽性表達(dá)，模型組、六味地黃湯組呈強(qiáng)陽性表達(dá)。計(jì)算各組陽性染色面積比，模型組明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)Dunnett T3法分析，P=0.013，即P<0.05，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。六味地黃湯組陽性表達(dá)強(qiáng)于假手術(shù)組，經(jīng)Dunnett T3法分析，P=0.000，即P<0.01，兩組比較有顯著性差異。六味地黃湯組陽性表達(dá)強(qiáng)于模型組，經(jīng)單因素方差分析Dunnett T3法分析，P=0.014，即P<0.05，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖3。

表1　六味地黃湯對(duì)5/6腎切除大鼠殘腎組織 HGF/C-met蛋白表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與假手術(shù)組相比，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05；與模型組相比，dP<0.01。

2.2.2c-Met蛋白表達(dá)免疫組化c-Met陽性表達(dá)為棕黃色顯色，主要表達(dá)于細(xì)胞胞膜。假手術(shù)組未見明顯陽性表達(dá)，模型組和六味地黃湯組在腎小管上皮細(xì)胞胞膜上和腎間質(zhì)上有陽性表達(dá)，部分腎小球系膜細(xì)胞胞膜亦有表達(dá)。計(jì)算各組陽性表達(dá)面積，模型組、六味地黃湯組表達(dá)明顯強(qiáng)于假手術(shù)組，經(jīng)Dunnett T3法分析，P=0.000，即P<0.01，差異有顯著性差異。六味地黃湯組表達(dá)強(qiáng)于模型組，經(jīng)Dunnett T3法分析，得出P=0.000，即P<0.01，兩組比較有顯著性差異。見表1和圖4。

3　討論

目前對(duì)于腎間質(zhì)纖維化形成的病理生理機(jī)制及其對(duì)應(yīng)的干預(yù)手段研究頗多。HGF作為一種對(duì)多種器官具有多效性的多肽細(xì)胞因子，是目前公認(rèn)的最重要的抗纖維化因子之一。王昆等[7]研究表明，用HGF干預(yù)，可以減輕結(jié)締組織生長(zhǎng)因子刺激下的人腎小管上皮間質(zhì)纖維化形成。外源性加入HGF后，對(duì)于高糖誘導(dǎo)引起腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大，從而減輕腎小管簡(jiǎn)直纖維化[8]。HGF抗纖維化作用機(jī)制可能包括：拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的致纖維化作用；維持細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解平衡；抗炎作用；抑制腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)變；抑制多種腎臟固有細(xì)胞的凋亡等[9]。c-Met是HGF的受體，其特點(diǎn)是高親和力低能力，HGF的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)主要是通過與c-Met結(jié)合完成。HGF與c-Met特異結(jié)合后，誘導(dǎo)c-Met上的酪氨酸磷酸化。磷酸化后的酪氨酸殘基與含SH2功能區(qū)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合，聚集細(xì)胞內(nèi)分子，激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)傳到級(jí)聯(lián)從而產(chǎn)生生理效應(yīng)[10]。HGF/c-Met系統(tǒng)的表達(dá)上調(diào)是機(jī)體的一種防御反應(yīng)，對(duì)抑制腎間質(zhì)纖維化，維持、重建小管結(jié)構(gòu)和功能起重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎切除術(shù)后大鼠梗殘存腎臟的HGF、c-Met表達(dá)明顯升高。提示5/6腎切除術(shù)后，殘存腎小球高濾過，殘存腎小管高代謝，引起組織細(xì)胞損傷，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，HGF/c-Met系統(tǒng)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和損傷修復(fù)，從而有助于保護(hù)腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，抑制腎間質(zhì)纖維化的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用六味地黃湯對(duì)5/6腎切除術(shù)后大鼠干預(yù)后，HGF、c-Met表達(dá)明顯比模型組升高，腎間質(zhì)纖維化和腎小球等病理改變比模型組減輕，顯示六味地黃湯能有效促進(jìn)HGF、c-Met表達(dá)，從而延緩腎間質(zhì)纖維化。

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