馬鈴薯病毒的常用檢測(cè)方法

劉玲玲，韓黎明，張尚智，禹娟紅

（定西師范高等專(zhuān)科學(xué)校生化系，甘肅定西743000）

馬鈴薯病毒的常用檢測(cè)方法

劉玲玲*，韓黎明，張尚智，禹娟紅

（定西師范高等專(zhuān)科學(xué)校生化系，甘肅定西743000）

目前常用馬鈴薯病毒檢測(cè)的方法，主要包括寄主生物學(xué)檢測(cè)法、抗血清檢測(cè)法、電子顯微鏡檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法。重點(diǎn)討論了分子生物學(xué)方法中的各種RT-PCR方法。同時(shí)對(duì)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較，并總結(jié)出將傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合必將成為檢測(cè)植物病毒最經(jīng)濟(jì)有效的手段。

馬鈴薯病毒；檢測(cè)方法；統(tǒng)計(jì)；分析

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.），是世界上種植和食用國(guó)家最多的作物之一[1]。馬鈴薯是以無(wú)性繁殖為主的作物，很容易感染病毒，當(dāng)病毒侵入馬鈴薯體內(nèi)以后，主要通過(guò)改變馬鈴薯細(xì)胞的代謝途徑，使馬鈴薯正常的生理機(jī)能受到干擾和破壞，導(dǎo)致馬鈴薯發(fā)生病毒病。馬鈴薯病毒病是影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，目前已報(bào)道的感染馬鈴薯的病毒多達(dá)35種，類(lèi)病毒1種，其中分布廣泛、危害嚴(yán)重的馬鈴薯病毒有馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯A病毒（PVA）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）和馬鈴薯M病毒（PVM）等[2]。同時(shí)多種病毒可復(fù)合感染，加重了危害程度。但是由于馬鈴薯病毒病缺乏有效的防治藥劑，病毒病可繼代相傳，從而導(dǎo)致種薯退化，商品薯降低甚至絕產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

自從植物發(fā)現(xiàn)病毒以來(lái)，國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家們都在努力地尋找著適合某種病毒相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，各種檢測(cè)病毒的方法相繼問(wèn)世。

1 寄主生物學(xué)檢測(cè)法

傳統(tǒng)的生物學(xué)測(cè)定方法是以植物病毒在寄主上的表觀癥狀作為識(shí)別病害和檢測(cè)病毒的基礎(chǔ)。寄主生物學(xué)檢測(cè)法主要包括直觀檢測(cè)法和指示植物檢測(cè)法兩種。

1.1 直觀檢測(cè)法

直觀檢測(cè)法是根據(jù)病毒在馬鈴薯植株上的表現(xiàn)癥狀來(lái)判斷感病情況，即根據(jù)植株莖葉是否表現(xiàn)出某種病毒所特有的可見(jiàn)癥狀來(lái)確定病毒感染程度。

1.2 指示植物檢測(cè)法

指示植物檢測(cè)法最早是由美國(guó)的病毒學(xué)家Holmes[4]在1929年發(fā)現(xiàn)的。指示植物又稱(chēng)鑒別寄主，指的是對(duì)某種或某些特定病毒非常敏感，被感染后癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。常用的幾種馬鈴薯病毒的指示植物[5]（見(jiàn)表1）。

表1 幾種馬鈴薯病毒的指示植物及其感病癥狀Table 1 Indicator plants and syptoms of some potato viruses

從受檢馬鈴薯植株上取下葉片或者其他組織并研磨，通過(guò)摩擦或者媒介昆蟲(chóng)將汁液接種到寄主植物上使其細(xì)胞受到侵染，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后指示植物即可表現(xiàn)癥狀，通過(guò)觀察指示植物所表現(xiàn)出來(lái)的相應(yīng)癥狀來(lái)檢測(cè)馬鈴薯內(nèi)有無(wú)病毒以及帶何種病毒。2003年，吳凌娟等[6]用多種指示植物分離鑒定PVX，結(jié)果表明千日紅是一種很好的鑒定指示植物，因其發(fā)病時(shí)間短,易觀察。指示植物檢測(cè)法對(duì)于大批馬鈴薯試管苗生產(chǎn)的檢測(cè)不適用，但在PVX、PVY、PVS等病毒株系檢測(cè)上用的比較多[7]，并廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)或血清學(xué)檢測(cè)之前的初步鑒定。

寄主生物學(xué)檢測(cè)法是進(jìn)行病毒檢測(cè)常用的一種方法，也是進(jìn)行植物病毒診斷檢測(cè)的重要依據(jù)。但是，單獨(dú)使用此法存在著一定的局限性，一方面有些病毒在寄主植物上并不表現(xiàn)明顯的可見(jiàn)癥狀，或是只有經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間才能表現(xiàn)可見(jiàn)癥狀；另一方面由于田間病毒病癥狀易受到病毒種類(lèi)和株系、寄主品種和生育期、氣候及環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。但是，作為認(rèn)識(shí)植物病毒的基礎(chǔ)，寄主反應(yīng)的生物學(xué)意義仍然無(wú)法替代。把病毒的寄主生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法有效結(jié)合將為更好地認(rèn)識(shí)植物病毒提供新的研究系統(tǒng)[8]。

2 抗血清檢測(cè)法

植物病毒是由核酸和蛋白質(zhì)組成的核蛋白，因而是一種較好的抗原，給動(dòng)物注射后會(huì)產(chǎn)生抗體，這種抗原和抗體結(jié)合會(huì)引起血清凝集或沉淀反應(yīng)，即抗原和抗體之間發(fā)生的高度專(zhuān)一的免疫反應(yīng)，借助這種反應(yīng)就可用已知病毒的抗血清鑒定未知病毒的種類(lèi)。這個(gè)過(guò)程在很短時(shí)間內(nèi)即可完成，因此病毒的抗血清檢測(cè)法既靈敏又快捷，是目前常用的一種病毒檢測(cè)方法。

3 電鏡檢測(cè)法

自從Kausche等[9]首次在電鏡下看到煙草花葉病毒（TMV）以后，電鏡檢測(cè)法已成為植物病毒研究必不可少的常規(guī)手段之一。電鏡技術(shù)是通過(guò)觀察植物病毒顆粒形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、內(nèi)含體組成形狀和亞結(jié)構(gòu)等方面的特征來(lái)確定病毒的存在和種類(lèi)。現(xiàn)代電鏡的分辨率可達(dá)到0.5 nm，因此利用電鏡觀察，比生物學(xué)檢測(cè)更直觀，而且速度更快。目前運(yùn)用的電鏡負(fù)染技術(shù)和超薄切片技術(shù)觀察能夠診斷和檢測(cè)植物病毒。超薄切片技術(shù)尤其對(duì)一些未知病毒，難于提純的病毒材料，負(fù)染技術(shù)不能解決的檢測(cè)材料都可進(jìn)行，通過(guò)對(duì)組織細(xì)胞的直接觀察而得到解決，因此在病毒學(xué)檢測(cè)和脫毒快繁的實(shí)際生產(chǎn)中均有著特殊的重要性和不可取代的作用[10]。

4 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）是把抗原-抗體的免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相互結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種綜合性技術(shù)。自Casper[11]應(yīng)用ELISA方法鑒定了PLRV病毒后,這一技術(shù)在馬鈴薯病毒檢測(cè)中得到了應(yīng)用。經(jīng)不斷改進(jìn)和提高，目前已形成間接ELISA、雙抗體夾心法（DAS-ELISA）、三抗體夾心法（TAS-ELISA）、異種動(dòng)物抗體夾心法、A蛋白酶聯(lián)法、點(diǎn)免疫結(jié)合技術(shù)（Dot-ELISA,DIBA）等多種測(cè)試方法[12]。2000年，白艷菊等[13]通過(guò)改進(jìn)應(yīng)用快速DAS-ELISA法對(duì)5種馬鈴薯病毒PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV同時(shí)檢測(cè)。2006年，宋吉軒等[14]分別用改進(jìn)DAS-ELISA法和常規(guī)DAS-ELISA法檢測(cè)PVX、PVY、PVS、PLRV4種馬鈴薯病毒，顯示出直觀、實(shí)用、快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。目前TAS-ELISA技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測(cè)的不多[1]。張仲凱等[15]用TAS-ELISA檢測(cè)了馬鈴薯脫毒苗，并做了幾種檢測(cè)方法的比較，結(jié)果表明TAS-ELISA的靈敏度遠(yuǎn)高于DAS-ELISA的靈敏度。2006年，劉成科等[16]用TAS-ELISA檢測(cè)了百合無(wú)癥病毒，其靈敏度也高于DAS-ELISA和間接ELISA。DIBA既可采用直接ELISA，也可采用間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)，通常間接靈敏度要高于直接法。

5 分子生物學(xué)檢測(cè)法

傳統(tǒng)的生物學(xué)病毒檢測(cè)法靈敏度低，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以病毒為基礎(chǔ)的抗血清和酶聯(lián)免疫檢測(cè)法雖然靈敏度有所提高，但仍不能很好地檢測(cè)含量極少的韌皮部病毒及休眠種薯中的病毒[17]。分子生物學(xué)檢測(cè)法從核酸水平檢測(cè)病毒，因而靈敏度高、特異性強(qiáng)，能克服血清學(xué)及其他檢測(cè)方法中的一些缺點(diǎn)，可以進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè)，是目前發(fā)展最快、且最有發(fā)展前景的病毒檢測(cè)技術(shù)[18]。

5.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)法

PCR是一種體外擴(kuò)增DNA技術(shù)，常規(guī)PCR可檢測(cè)植物DNA病毒，RT-PCR可檢測(cè)植物RNA病毒。大多數(shù)植物病毒為RNA病毒，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行PCR反應(yīng)，此方法稱(chēng)為RTPCR[1]檢測(cè)法。2005年，關(guān)翠萍等[19]用一步RT-PCR法對(duì)馬鈴薯中的PVX、PVY和PLRV做了檢測(cè)，由此提出了馬鈴薯病毒一步法RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。袁青等[20]用二重RT-PCR快速檢測(cè)PVY和PLRV，PVX和PVA的混合病毒，結(jié)果表明，此法適用于大量樣品的快速制備，并為馬鈴薯病毒病的早期診斷提供了一定的依據(jù)。陳陽(yáng)婷等[21]運(yùn)用三重RT-PCR快速檢測(cè)法對(duì)馬鈴薯中的多種復(fù)合感染病毒（PVX、PVS和PVA；PVX、PVS和PLRV；PVX、PVA和PLRV；PVS、PVA和PLRV）進(jìn)行檢測(cè)，建立了三重RTPCR檢測(cè)技術(shù)。代廷非[22]運(yùn)用多重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了馬鈴薯的多種病毒。多重RT-PCR技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)幾種病毒，節(jié)約時(shí)間并提高了工作效率[23]。

5.2 指示分子NASBA檢測(cè)法

該檢測(cè)法是以RNA轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的等溫?cái)U(kuò)增法，適用于RNA病毒的擴(kuò)增，一般可通過(guò)分子雜交判斷擴(kuò)增結(jié)果，也可在有雙鏈DNA存在的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)單鏈RNA的特異擴(kuò)增，具有高度的特異性[24]。目前此法可以對(duì)多種不同類(lèi)病毒甚至同一類(lèi)病毒的不同株系進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)[25,26]。

5.3 核酸雜交檢測(cè)技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是指具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，將已知核酸序列制成含有某種標(biāo)記的探針，再與互補(bǔ)的待測(cè)樣品核酸雜交，帶有探針的雜交核酸能指示病原的存在。目前有核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Nucleic acid spot hybridization,NASH）和PCR微量板雜交檢測(cè)技術(shù)兩種。1983年，Maule等[27]報(bào)道了應(yīng)用NASH檢測(cè)病毒。1993年，Querci[28]用該方法成功的檢測(cè)了PVX不同分離株系。但是NASH也存在一定的缺點(diǎn)，比如在檢測(cè)大量樣品時(shí)，探針的分離比較困難。而且在檢測(cè)休眠種薯中的病毒時(shí)，檢測(cè)靈敏度還不高，尤其對(duì)于PVY和PLRV兩種病毒[29]。

6 結(jié)論

以上所歸納總結(jié)的幾種方法都是馬鈴薯病毒檢測(cè)的常用方法，每種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確、直觀、易于操作，但耗時(shí)長(zhǎng)，已經(jīng)遠(yuǎn)不能適應(yīng)生產(chǎn)的需要?？寡鍣z測(cè)法快速、靈敏，適于大規(guī)模樣品的檢測(cè)，但是在抗血清的制備上存在著很多不足。但在生產(chǎn)實(shí)踐中，具體使用哪一種檢測(cè)方法就要根據(jù)病毒的不同類(lèi)型，技術(shù)掌握程度，設(shè)備等具體條件的不同，選擇最適宜的檢測(cè)方法。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善及相關(guān)儀器的普及推廣，分子生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行，但是也存在著很多缺點(diǎn)，所以將傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合必將成為最經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)手段。

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Common Test Methods for Potato Virus Detection

LIU Lingling＊,HAN Liming,ZHANG Shangzhi,YU Juanhong
(Department of Biochemistry,Dingxi Teachers College,Dingxi,Gansu 743000,China)

The common test methods for potato virus detection were reviewed,including host biology detection, antiserological detection assay,electron microscopy,enzyme-linked immunosorbent assay and molecular biological detection assay,with emphasis on the various RT-PCR methods of molecular biology methods.At the same time,the merit and demerit were compared with different methods,concluding that the combination of traditional biological detection,immunological detection and molecularbiology detection technology would be the mostcost-effective means fordetection ofplantviruses.

potato virus;detection method;statistic;analysis

S532

B

1672－3635（2013）04-0239-04

2013-04-08

定西師范高等專(zhuān)科學(xué)校校級(jí)科研項(xiàng)目（1316）。

劉玲玲（1977-），女，講師，碩士，主要從事生物技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用研究。

劉玲玲，E-mail：llliu112@163.com。