現(xiàn)場制備表面增強拉曼光譜基底法快速檢測藥片中鹽酸阿米洛利的含量

黃天雄，王文明，陳萬超，陸偲倩，杜一平

(上海功能性材料化學重點實驗室,華東理工大學 化學與分子工程學院,上海 200237)

利尿劑是治療高血壓等疾病的常用藥，其機理是作用于腎臟以增加電解質(zhì)、水分排泄和增加尿量的藥物，根據(jù)其作用機制可分為三大類，即環(huán)式利尿劑、噻嗪類利尿劑和保鉀利尿劑[1]。鹽酸阿米洛利(N-脒基-3,5-二氨基-6-氯吡嗪-2-甲酰胺)屬于第三類利尿劑，其作用于腎遠曲小管，促使鈉、氯離子排泄而減少鉀、氫離子的分泌。復方鹽酸阿米洛利片主要由鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪復方制成，兼具保鉀利尿和抗高血壓的作用，常被用于治療高血壓病，以及心力衰竭和肝硬化等導致的水腫和腹水。但此藥物過量或者不當使用會導致低鈉血癥、高血鉀癥，以及氮質(zhì)血癥和高尿酸血癥。因此，對于此藥物的生產(chǎn)、使用過程需嚴格的定量監(jiān)控。目前，鹽酸阿米洛利的定量分析方法主要有高效液相色譜法[2-3]和液相色譜-質(zhì)譜法[4-5]。但這些方法需要昂貴的儀器設備，且體積龐大不易攜帶，檢測耗時較長，樣品前處理過程較復雜，不適用于大量樣本的快速檢測。使用漫反射光譜法[6]和電化學法[7]檢測鹽酸阿米洛利雖然樣品前處理簡單，檢測快速，但其抗干擾能力相對較低。因此，建立一種適用于藥片中鹽酸阿米洛利的簡便、快速、靈敏的定量檢測方法具有實際意義。

表面增強拉曼光譜(SERS)由于具有水分干擾小、檢測快速、靈敏度高和能提供分子化學結(jié)構信息等優(yōu)點，廣泛應用于藥物分析[8-9]、食品安全[10-11]、環(huán)境檢測[12]等領域，而使用SERS對于鹽酸阿米洛利的檢測尚未發(fā)現(xiàn)報道?；资褂脡勖淌悄壳癝ERS最主要的缺點之一，嚴重限制了其在實際樣品檢測中的應用。本文通過對銀溶膠合成工藝進行優(yōu)化，利用便捷的加熱貼快速制備銀溶膠，實現(xiàn)了現(xiàn)場合成基底用于SERS檢測，無需事先購買基底，避免了基底壽命短的影響。將研發(fā)的基底用于藥片中鹽酸阿米洛利的定量檢測，并對分析性能進行評價。本工作為藥片中鹽酸阿米洛利含量的測定提供了一個快速、便捷的定量檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

i-Raman拉曼光譜儀(美國B&W Tek公司)，二極管激光器，激發(fā)波長為785 nm，最大激發(fā)功率為300 mW，積分時間為10 s，配備顯微拉曼檢測平臺(20倍物鏡)；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

抗壞血酸(上海笛柏生物科技有限公司)，硝酸銀(上海泰坦科技股份有限公司)，檸檬酸三鈉(上海凌峰化學試劑有限公司)，鹽酸阿米洛利(阿拉丁試劑公司)，羅丹明6G(R6G，阿拉丁試劑公司)，氯化鈉(百靈威科技有限公司)，上述試劑均為分析純；復方鹽酸阿米洛利藥片(江蘇迪賽諾制藥有限公司)，加熱貼(大連華納科技有限公司)。所有試劑在使用過程中均未進行再提純。實驗用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)，由德國 Sartorius arium 611DI超純水儀制備得到。

1.2 銀溶膠的制備

在Qin等[13]的基礎上改進了銀溶膠的制備方法：以抗壞血酸作為還原劑，檸檬酸三鈉為穩(wěn)定劑，通過還原硝酸銀制備銀溶膠基底。稱取10.7 mg抗壞血酸和59.4 mg檸檬酸三鈉，用水溶解并定容至100 mL，取8 mL混合溶液于10 mL玻璃瓶(內(nèi)徑為18.4 mm，高度為65 mm)中。取一片加熱貼，待升溫至50 ℃，貼在玻璃瓶外壁，并向玻璃瓶中加入0.08 mL 0.1 mol/L的AgNO3溶液，反應15 min后，撤去加熱貼，冷卻得到灰色的銀溶膠，避光存放待用。

1.3 樣品的制備

使用水溶解10 mg的鹽酸阿米洛利標準品，得到100 mg/L的鹽酸阿米洛利儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。移?4個不同體積的鹽酸阿米洛利儲備液進行稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為0.8、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28 mg/L 的鹽酸阿米洛利標準溶液，于4 ℃保存。

取一片復方鹽酸阿米洛利藥片(約0.1 g)研磨，準確稱取0.030 0 g的藥片粉末，加適量水超聲溶解后，用水定容至100 mL，溶液過 0.22 μm的聚醚砜膜，得到復方鹽酸阿米洛利藥片儲備液。采用加標回收的方法評價檢測方法的準確度：取 2 mL藥片儲備液和0、1、2、3 mL 20 mg/L的鹽酸阿米洛利標準溶液分別混合后，用水稀釋至10 mL，得到藥片的待測樣本，每個加標濃度配制3個樣本。

1.4 SERS光譜的檢測

取200 μL銀溶膠至2 mL離心管，加入200 μL樣品溶液和100 μL 1%的NaCl溶液，振蕩，取一定量于石英玻璃片上，利用便攜式拉曼光譜儀，通過將激光光斑聚焦于液滴表面來實現(xiàn)SERS信號的采集。樣本的采集參數(shù)如下：激光波長785 nm，激光功率300 mW，物鏡倍數(shù)20倍，積分時間10 s，每個樣本采集5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀溶膠的制備與表征

在銀溶膠的制備中，實驗溫度控制著反應的速度并最終影響合成銀納米顆粒的形狀和均一性[14-15]。本文在不同的水浴溫度下合成銀溶膠，以R6G為探針分子，采用在1 364 cm-1和1 511 cm-1處的特征峰強度[16]對合成的銀溶膠進行SERS表征，以考察不同溫度合成的銀溶膠對SERS增強效果的影響。圖1A為不同水浴溫度下，所合成的銀溶膠測得R6G的SERS強度變化趨勢，圖中的強度和誤差棒均由3次平行SERS檢測計算而得。可以看出水浴溫度50 ℃下所合成銀溶膠的SERS強度最高，當溫度較低和較高時，SERS信號強度均有所降低。

圖1 不同溫度下合成的銀溶膠所測得R6G在1 364 cm-1和1 511 cm-1處的SERS信號(A)，以及使用3次加熱貼合成的銀溶膠與水浴50℃下制備的銀溶膠測得R6G的SERS信號(B)Fig.1 SERS intensities located at 1 364 cm-1 and 1 511 cm-1 of R6G determined by silver colloid synthesized at different temperatures(A), and SERS intensities of R6G determined by silver colloid synthesized by three pieces of heating pasters and at 50 ℃(B)

圖2 加熱貼合成的銀溶膠的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of silver colloid synthesized by heating paster

為了更便捷地合成銀溶膠，本文采用加熱貼取代水浴鍋為銀溶膠的熱源。圖1B比較了水浴方式和加熱貼方式所制備基底的SERS檢測光譜強度，圖中a、b、c分別為使用3片同一批次加熱貼制備的銀溶膠檢測R6G的SERS強度，50 ℃表示采用水浴鍋在50 ℃下制備的基底的測定結(jié)果。圖1B顯示，使用3片同一批次(a、b、c)加熱貼制備的銀溶膠比較穩(wěn)定，SERS強度相差不大，1 364 cm-1峰強度批次間的相對標準偏差(RSD)為3.0%；1 511 cm-1峰強度批次間的RSD為2.3%。但其光譜強度明顯低于水浴加熱方式的光強。其原因可能是水浴能提供一個恒定的溫度狀態(tài)，而加熱貼則處于持續(xù)升溫或降溫過程，因此所制備的銀納米顆粒SERS增強效果不如水浴加熱制備的銀溶膠。此外，通過加熱貼制備的銀溶膠納米顆粒粒徑集中在80 nm左右(圖2)，產(chǎn)生SERS信號的熱點較少，導致SERS強度降低。但考慮到現(xiàn)場分析條件有限(如在野外、車間、市場、流通環(huán)節(jié)等)，加熱貼即拆即用，能夠快速、便捷地合成銀溶膠，因此，本文采用加熱貼為熱源?，F(xiàn)場制備的銀溶膠在4 h內(nèi)可以保持穩(wěn)定，如果超過4 h則需重新制備銀溶膠。

圖3 鹽酸阿米洛利標準品固體粉末的拉曼光譜(A)，7.15 mg/L藥片儲備液(B)及8 mg/L鹽酸阿米洛利標準溶液(C)的SERS光譜Fig.3 Raman spectrum of amiloride hydrochloride solid powder(A)，SERS spectra of 7.15 mg/L tablet stock solution(B)and 8 mg/L amiloride hydrochloride standard(C)

2.2 鹽酸阿米洛利的SERS譜圖分析

使用加熱貼制備的銀溶膠測量了鹽酸阿米洛利標準品(固體粉末)的普通拉曼光譜，以及7.15 mg/L藥片儲備液和8 mg/L的鹽酸阿米洛利標準溶液的SERS光譜(圖3)。從圖中可見，三者的拉曼光譜峰一致性很好，主要譜峰可歸屬為742 cm-1(C—N—C伸縮振動)，1 384 cm-1(C—C伸縮振動)，1 516 cm-1(酰胺ⅡC—N伸縮振動)[17-18]。鑒于1 384 cm-1處的SERS信號強，受干擾小，因此選用其為分析峰進行后續(xù)的定量分析。

2.3 鹽酸阿米洛利的定量檢測

使用現(xiàn)制備的銀溶膠對不同質(zhì)量濃度(0～28 mg/L)的鹽酸阿米洛利標準溶液進行檢測，其SERS光譜圖如圖4A所示。由圖可知，檢測濃度低至0.8 mg/L時，仍可觀察觀察到較為明顯的特征峰。圖4B為峰強度與鹽酸阿米洛利質(zhì)量濃度的關系曲線，由插圖可知，在0.8～8 mg/L之間質(zhì)量濃度(ρ,mg/L)與1 384 cm-1處的拉曼峰強度(y)呈較好的線性關系，線性方程為：y=1 395ρ-76.40,r2=0.999 2。按空白溶液5次測定結(jié)果標準偏差的3倍，計算檢出限(LOD)為0.2 mg/L。

為進一步評估本方法的可靠性，按照“1.3”進行加標回收實驗，結(jié)果如表1所示。測得未加標樣品濃度為1.43 mg/L，與藥品標識濃度的折算濃度1.31 mg/L比較接近。3個加標水平下的回收率為104%～106%，RSD為0.35%～3.5%，表明該方法具有較理想的檢測準確度和精密度，適用于藥片中鹽酸阿米洛利的快速檢測。

圖4 不同質(zhì)量濃度鹽酸阿米洛利的SERS譜圖(A)，以及1 384 cm-1下SERS信號強度與質(zhì)量濃度的關系圖(B)Fig.4 SERS spectra of amiloride hydrochloride with different concentrations(A),and relationship between SERS intensity and concentration of amiloride hydrochloride at 1 384 cm-1(B) concentration of amiloride hydrochloride(a-i):28,20，10,8,4，2,1,0.8,0 mg/L

*no data

3 結(jié) 論

本文提出了快速、簡便的銀溶膠制備方法，以適用于現(xiàn)場的快速SERS檢測，使用所研發(fā)的銀溶膠對藥片中鹽酸阿米洛利進行定量分析。結(jié)果表明，在0.8～8 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關系，相關系數(shù)(r2)為0.999 2，LOD為0.2 mg/L，平均加標回收率為104%～106%，RSD為0.35%～3.5%，方法具有較佳的可靠性和準確性。同時，本文提出的基底制備和使用方法快速、簡便、不受基底壽命的影響，可為藥物的SERS分析提供一條有效的途徑，有望在藥物分析中得到廣泛應用。