中國(guó)云南8種堇菜屬植物的葉形態(tài)解剖特征及分類學(xué)意義

田 琴 邵成艷 段涵寧 楊晨璇，4 李 璐*

（1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224 ；3.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明650224；4.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，昆明 650201）

堇菜屬（Viola）是堇菜科（Violaceae）最大的一個(gè)屬，有525～600 余種，為世界廣布屬，幾乎廣泛生長(zhǎng)在世界無(wú)霜區(qū)［1］。它起源于安第斯山脈，分布于世界溫帶地區(qū)以及熱帶亞熱帶的高海拔山區(qū)，集中在歐洲的阿爾卑斯山和地中海、亞洲的喜馬拉雅和東亞地區(qū)，以及南美洲的安第斯山脈和巴塔哥尼亞等地［1-3］。該屬為多年生草本植物，部分種類具有較高觀賞價(jià)值［1-4］，如：著名的三色堇（V.tricolor）和七星蓮（V.diffusa），也有一些藥用植物，如：紫花地?。╒.philippica）和荁（V.moupinensis）。

長(zhǎng)期以來(lái)，由于物種多、分布廣、生態(tài)型明顯、兼具開(kāi)放花和閉鎖花，且普遍具有自然雜交現(xiàn)象，堇菜屬的物種鑒定和屬下分類系統(tǒng)爭(zhēng)議較大。1823年，Gingins［5］根據(jù)柱頭形態(tài)把堇菜屬分為5個(gè)組。1925年，Becker［6］基于雌蕊的超微結(jié)構(gòu)后把它細(xì)分為14 組28 亞組及7 系。緊接著，Clausen［7-10］在此基礎(chǔ)上，不斷擴(kuò)充修訂該分類系統(tǒng)，明確指出花瓣顏色、雌蕊形態(tài)、染色體數(shù)目及地理分布類型等都是屬下分組的重要依據(jù)。1996 年，Ballard［11］根據(jù)形態(tài)學(xué)、染色體數(shù)目和自然雜交現(xiàn)象等提出堇菜屬可以分為8 個(gè)組，并具相應(yīng)的地理分布格局，同時(shí)指出哪些組是存疑類群。近年來(lái)，分子系統(tǒng)學(xué)為探討堇菜屬的分類學(xué)系統(tǒng)提供了新證據(jù)。Ballard 等［1］選擇了堇菜屬下大部分組的44 個(gè)代表種為材料，基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)序列（ITS 序列）構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹(shù)，證實(shí)該屬起源于南美安第斯山脈，揭示了屬下分組類群并非單系。基于8個(gè)葉綠體基因片段構(gòu)建的韓國(guó)堇菜屬分子系統(tǒng)學(xué)表明，該地區(qū)的二裂柱頭堇菜組和須毛柱頭堇菜組（sectionsDischidium&Chamaemelanium）為單系，而其他組為并系，建議根據(jù)形態(tài)特征在組下進(jìn)一步細(xì)分［12］。同樣地，中國(guó)堇菜屬分類系統(tǒng)也存在類似問(wèn)題。我國(guó)堇菜屬先記錄有111種，分為4亞屬14組［2］，后被修訂為96種（含35個(gè)中國(guó)特有種），分為5 亞屬，但未進(jìn)一步分組［3］。目前，我國(guó)堇菜屬的分子系統(tǒng)學(xué)研究資料不多，主要是基于ITS片段構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)證據(jù)展開(kāi)討論，認(rèn)為中國(guó)堇菜屬不宜分為4個(gè)亞屬，堇菜亞屬不是單系，討論了部分組間的親緣關(guān)系及形態(tài)特征演化趨勢(shì)［13-14］。

現(xiàn)有資料表明，堇菜屬的葉表皮細(xì)胞形態(tài)、毛被特征、氣孔類型、葉和葉柄的橫切面解剖結(jié)構(gòu)等在種間差異顯著，為近似種的劃分和屬內(nèi)組間分類提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)，但大部分研究集中在伊朗［15-17］、北美［18］和夏威夷地區(qū)［19］、澳大利亞［20-21］、我國(guó)東北及東部地區(qū)的一些種類［22-25］。這些研究說(shuō)明對(duì)于種類較多、分布廣，且分類困難的堇菜屬，以某個(gè)地域的分布物種為研究對(duì)象，不斷積累資料，對(duì)于全面理解其分類系統(tǒng)是有幫助的。云南是中國(guó)堇菜屬物種最豐富的地區(qū)，占了全國(guó)近一半以上的種類，約有56 種及4 變種［26］，但該地區(qū)的相關(guān)研究資料較少。野外調(diào)查中，作者發(fā)現(xiàn)云南常見(jiàn)的一些堇菜屬植物的花形態(tài)較為相似，容易混淆，也常被列為鑒定困難的近似種，包括產(chǎn)于滇西北開(kāi)黃花的灰葉堇菜（V.delavayi）和雙花堇菜（V.biflora），在滇中地區(qū)開(kāi)紫花的紫花地丁、早開(kāi)堇菜（V.prionantha）和香堇菜（V.odorata）等。同時(shí)，筆者觀察到葉型在這些常見(jiàn)種間變化明顯，可用于物種鑒定，值得深入研究。例如，卵形葉最常見(jiàn)，見(jiàn)于紫花地丁、早開(kāi)堇菜、香堇菜、七星蓮和灰葉堇菜，但前4 種被放置在堇菜亞屬（subgen.Viola），而灰葉堇菜為二裂花柱亞屬（subgen.Dischidium）。腎形葉、戟形葉和三裂葉等葉型較為少見(jiàn)，分別見(jiàn)于雙花堇菜、長(zhǎng)萼堇菜（V.inconspicua）和南山堇菜（V.chaerophylloides），在當(dāng)?shù)剌啦藢倮镂锓N辨識(shí)度較高。

綜上所述，本研究選取上述云南常見(jiàn)的8種堇菜屬植物為研究對(duì)象（見(jiàn)表1），采納中國(guó)堇菜屬分為4亞屬14組的分類系統(tǒng)［2］，通過(guò)醋酸離析法和石蠟切片技術(shù)，在顯微鏡下觀察其葉表皮形態(tài)、葉片和葉柄橫切面解剖結(jié)構(gòu)，比較種間的葉形態(tài)差異，為該屬的物種分類提供新資料。

表1 8種堇菜屬植物的基本信息［2］Table 1 Data of eight Viola species observed［2］

2 材料與方法

2.1 材料

8 種堇菜屬植物（見(jiàn)表1）采集于2020—2021年春夏花期。野外觀察拍照記錄植株、花和葉片的形態(tài)特征，采集成熟葉片固定于50%乙醇，常溫保存。其中，灰葉堇菜和雙花堇菜屬于二裂花柱亞屬的短距堇菜組，分別采自大理市雞足山和麗江市黑龍?zhí)豆珗@。其余6 種代表了堇菜亞屬的4個(gè)組，均采自昆明植物園。值得說(shuō)明的是，灰葉堇菜為中國(guó)特有種（僅分布于云南、貴州和四川），香堇菜為國(guó)外引種栽培多年的觀賞植物，其余6種皆為北半球廣布種，在云南均有分布，生長(zhǎng)在溫帶和亞熱帶地區(qū)的林緣、灌木、草地和溪邊等［2］。

2.2 方法

2.2.1 醋酸離析法觀察葉表皮形態(tài)

取固定后的葉片，沿中脈取1 cm×1 cm 的小塊，置于盛有適量解離液（V（30%過(guò)氧化氫）∶V（醋酸）=1∶1）［27］的小坩堝中。在烘箱中60 ℃加熱3～5 h，待葉表皮與葉肉組織分離后取出（必要時(shí)可用毛筆清除葉肉殘留組織），清水漂洗2～3 次后，置于潔凈的載玻片上并滴1～2 滴1%番紅染液，染色1～3 min。蓋上蓋玻片，洗去浮色，制作成臨時(shí)裝片，在尼康顯微鏡（DM750，日本）下觀察拍照。觀察上、下葉表皮的毛被類型、表皮細(xì)胞和氣孔類型及密度，利用Image J 軟件測(cè)量它們的大小，隨機(jī)測(cè)量記錄30 個(gè)數(shù)據(jù)，求平均值。其中，氣孔指數(shù)=氣孔數(shù)量/（氣孔數(shù)量+葉表皮細(xì)胞數(shù)量）。專業(yè)術(shù)語(yǔ)參照文獻(xiàn)［28］。

2.2.2 石蠟切片法觀察葉中脈和葉柄橫切面結(jié)構(gòu)

取固定后的葉片，沿中脈處取葉片小塊（0.5 cm×0.5 cm）和距葉柄基部約1 cm 處截取0.5 cm 長(zhǎng)的葉柄段，每個(gè)物種各取5份樣品。樣品經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、常規(guī)石蠟切片（手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，Leica RM2125 RTS，德國(guó)），切片厚度為8 μm。切片烘干后，經(jīng)番紅-固綠染色，加拿大樹(shù)脂膠封片，晾干后，在光學(xué)顯微鏡（Leica DM 750，德國(guó)）下觀察葉片和葉柄橫切面特征，包括上、下表皮層、維管束輪廓、葉肉和柵欄組織等；利用Image J軟件測(cè)量它們的數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 8種堇菜屬植物的植株形態(tài)

8 種堇菜屬植物在開(kāi)花期時(shí)的植株形態(tài)特征差異明顯，包括生長(zhǎng)習(xí)性、葉型及花形態(tài)等（圖版Ⅰ）。首先，生長(zhǎng)習(xí)性包括1年生和多年生草本，前者出現(xiàn)在七星蓮（圖版Ⅰ：6），后者出現(xiàn)在其余7個(gè)種。其次，成熟葉片幾乎光滑無(wú)毛，葉形態(tài)在種間變化明顯，可分為4 種：卵形葉（Ovate-shaped）、腎形葉（Reniform-shaped）、戟形葉（Hastate-shaped）和三全裂葉（Tri-lobed）。其中，卵形葉最普遍，出現(xiàn)在4 種：灰葉堇菜（圖版Ⅰ：2）、紫花地丁（圖版Ⅰ：5）、早開(kāi)堇菜（圖版Ⅰ：4）和香堇菜（圖版Ⅰ：7）。相反，腎形葉、戟形葉和三全裂較為獨(dú)特，分別見(jiàn)于雙花堇菜（圖版Ⅰ：1）、長(zhǎng)萼堇菜（圖版Ⅰ：3）和南山堇菜（圖版Ⅰ：8）。再次，花色變異在組間有一定規(guī)律，可分為黃花、紫花和白花。黃花出現(xiàn)在二裂花柱亞屬的雙花堇菜和灰葉堇菜（圖版Ⅰ：1～2）；紫花出現(xiàn)在堇菜亞屬的3組4種，包括長(zhǎng)萼堇菜（圖版Ⅰ：3）、早開(kāi)堇菜（圖版Ⅰ：4）、紫花地?。▓D版Ⅰ：5）、七星蓮（圖版Ⅰ：6）和香堇菜（圖版Ⅰ：7）；而白花僅出現(xiàn)在南山堇菜（圖版Ⅰ：8）。

圖版Ⅰ 8種堇菜屬植物的植株形態(tài)1.雙花堇菜；2.灰葉堇菜；3.長(zhǎng)萼堇菜；4.早開(kāi)堇菜；5.紫花地??；6.七星蓮；7.香堇菜；8.南山堇菜Plate Ⅰ Plant morphology of eight Viola species1.Viola biflora；2.V.delavayi；3.V.inconspicua；4.V.prionantha；5.V.philippica；6.V.diffusa；7.V.odorata；8.V.chaerophylloides

3.2 8種堇菜屬植物的葉表皮特征

3.2.1 毛被特征

肉眼觀察下，8種植物在開(kāi)花期成熟葉片幾乎光滑無(wú)毛。但在顯微鏡下，除雙花堇菜、長(zhǎng)萼堇菜和香堇菜3 種的葉下表皮無(wú)毛外，其余5 種的葉片上下表皮均觀察到長(zhǎng)度不等、分布在葉緣和葉脈上的單列-單細(xì)胞-毛狀體（uniseriately singlecelled trichome）（圖版Ⅱ）。毛狀體的長(zhǎng)度在同種植物葉上下表皮的變化不大，但在種間差異明顯，最長(zhǎng)的出現(xiàn)在灰葉堇菜的上（903.69 μm）、下表皮（676.39 μm），最短的出現(xiàn)在南山堇菜的上（62.86 μm）、下表皮（136.94 μm）。根據(jù)長(zhǎng)度，葉表皮毛被可分為三類：短柱狀毛、中柱狀毛和長(zhǎng)柱狀毛。第一類短柱狀毛，是指毛狀體長(zhǎng)度小于150 μm，見(jiàn)于2 個(gè)種，包括南山堇菜的上、下表皮，密集在葉脈及葉緣（圖版Ⅱ：1～2）和香堇菜的上表皮（67.14 μm）的葉緣處（圖版Ⅱ：3）。第2類中柱狀毛，是指毛狀體長(zhǎng)度在150～300 μm，見(jiàn)于3種植物，包括雙花堇菜和長(zhǎng)萼堇菜的上表皮（分別為249.45、177.61 μm），前者密集分布于葉緣細(xì)齒處（圖版Ⅱ：5），后者均勻分布（圖版Ⅱ：6），以及紫花地丁的上（219.61 μm）、下表皮（162.88 μm），集中分布于葉緣及葉脈（圖版Ⅱ：4）。第3 類長(zhǎng)柱狀毛，是指毛狀體長(zhǎng)度大于300 μm，見(jiàn)于3 種，包括七星蓮的上（310.82 μm）、下表皮（630.46 μm）（圖版Ⅱ：8），灰葉堇菜的上（903.69 μm）、下表皮（676.39 μm）（圖版Ⅱ：9）。但早開(kāi)堇菜的上下表皮的毛被長(zhǎng)度略有差異，下表皮為中柱狀毛（201.49 μm），上表皮為長(zhǎng)柱狀毛（311.89 μm）（圖版Ⅱ：7），密集分布在葉脈及葉緣。

圖版Ⅱ 8種堇菜屬植物的3類葉表皮毛被類型1～3.短柱狀毛（1，2.南山堇菜（中脈，葉緣）；3.香堇菜）；4～6.中柱狀毛（4.紫花地?。?.雙花堇菜；6長(zhǎng)萼堇菜）；7～9.長(zhǎng)柱狀毛（7.早開(kāi)堇菜；8.七星蓮；9.灰葉堇菜）Plate Ⅱ Three types of leaf trichome in eight Viola species1-3.Short-column trichome（1-2.V.chaerophylloides（midrib，ridge）；3.V.odorata）；4-6.Medium-column trichome（4.V.philippica；5.V.biflora；6.V.inconspicua）；7-9.Long-column trichome（7.V.prionantha；8.V.diffusa；9.V.delavayi）

3.2.2 葉表皮細(xì)胞和氣孔特征

在顯微鏡下（圖版Ⅲ，表2），同種植物葉表皮的上表皮細(xì)胞比下表皮細(xì)胞大，形態(tài)和垂周壁樣式多為不規(guī)則形-淺波狀或深波狀，只有雙花堇菜的為多邊形-平直弓形（圖版Ⅲ：1～2）。同種植物的上下表皮細(xì)胞在4 個(gè)種里相同，其余4 個(gè)種不同。相同的出現(xiàn)在包括雙花堇菜在內(nèi)的4種：長(zhǎng)萼堇菜的為不規(guī)則淺波狀（圖版Ⅲ：9～10），紫花地丁和七星蓮為不規(guī)則深波狀（圖版Ⅲ：11～12，13～14）。不同的見(jiàn)于另4種：早開(kāi)堇菜和南山堇菜的上表皮為淺波狀（圖版Ⅲ：3，15），下表皮為深波狀（圖版Ⅲ：4）；香堇菜和灰葉堇菜的上表皮為多邊形和平直-弓形（圖版Ⅲ：5，7），下表皮為不規(guī)則型和深波狀（圖版Ⅲ：6，8）。

表2 8種堇菜屬植物的葉表皮形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of leaf epidermis in eight Viola species

8種植物均具不等型氣孔，在灰葉堇菜和七星蓮里還觀察到少量的平列型和橫列型（圖版Ⅲ：7～8，13～14）。它們的氣孔主要分布于葉下表皮，密度較高，為密集型氣孔。除長(zhǎng)萼堇菜和南山堇菜外，其余6 種的上表皮也觀察到少量氣孔，但密度較低為稀疏型。氣孔有2種，除了長(zhǎng)萼堇菜和香堇菜的氣孔為近圓形（長(zhǎng)寬比為1.04～1.20）外，其余6種都為橢圓形（長(zhǎng)寬比為1.20～1.50）。

圖版Ⅲ 8種堇菜屬植物的葉表皮特征1～2.雙花堇菜（上表皮，下表皮）；3～4.早開(kāi)堇菜（上表皮，下表皮）；5～6.香堇菜（上表皮，下表皮）；7～8.灰葉堇菜（上表皮，下表皮）；9～10.長(zhǎng)萼堇菜（上表皮，下表皮）；11～12.紫花地?。ㄉ媳砥?，下表皮）；13～14.七星蓮（上表皮，下表皮）；15.南山堇菜（上表皮）Plate Ⅲ Morphological characteristics of leaf epidermis in eight Viola species1， 2.Viola biflora（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；3， 4.V.prionantha（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；5， 6.V.odorata（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；7， 8.V.delavayi（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；9， 10.V.inconspicua（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；11， 12.V.philippica（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；13， 14.V.diffusa（Adaxial epidermis，Abaxial epidermis）；15.V.chaerophylloides（Adaxial epidermis）

3.3 8種堇菜屬植物的葉中脈橫切面解剖特征

8種植物的葉中脈橫切面均由角質(zhì)層、上下表皮層、柵欄組織、葉肉細(xì)胞和維管束組成（圖版Ⅳ）。其中，上表皮細(xì)胞比下表皮的大，柵欄組織普遍分化不明顯，部分物種存在方形晶狀體，分布于柵欄和薄壁細(xì)胞之間，以雙花堇菜最明顯（圖版Ⅳ：6），香堇菜（圖版Ⅳ：1）和灰葉堇菜的零星可見(jiàn)（圖版Ⅳ：5）。結(jié)果表明，葉中脈處的表皮突起和葉片厚度在種間差異明顯（表3）。首先，葉中脈橫切面主維管束處的上下表皮突起，來(lái)源于表皮下多了1層細(xì)胞形態(tài)相似的次生表皮細(xì)胞，由于種內(nèi)和種間的上下表皮細(xì)胞大小不同，故形成大小相似的均等型和大小不同的不等型突起。前者指上下表皮突起微微向外隆起，大小形態(tài)一致、近似對(duì)稱（圖版Ⅳ：1～4），出現(xiàn)在4 種：香堇菜（圖版Ⅳ：1）、紫花地?。▓D版Ⅳ：2）、長(zhǎng)萼堇菜（圖版Ⅳ：3）和七星蓮（圖版Ⅳ：4）中。后者指上下表皮突起輪廓形態(tài)大小不一，見(jiàn)于另4種：灰葉堇菜（圖版Ⅳ：5）、雙花堇菜（圖版Ⅳ：6）、早開(kāi)堇菜（圖版Ⅳ：7）和南山堇菜（圖版Ⅳ：8）。再次，葉片厚度在種間也有差異，分為厚葉型（＞200 μm）和薄葉型（≤200 μm），前者見(jiàn)于3個(gè)種：雙花堇菜（267.81 μm）、紫花地?。?18.76 μm）和南山堇菜（208.76 μm）；后者出現(xiàn)在5種：灰葉堇菜（109.84 μm）、長(zhǎng)萼堇菜（158.35 μm）、早開(kāi)堇菜（143.45 μm）、七星蓮（151.66 μm）、香堇菜（195.88 μm）。其中葉片最厚的見(jiàn)于雙花堇菜，最薄的出現(xiàn)在灰葉堇菜，兩者厚度相差近2.5倍。

圖版Ⅳ 8種堇菜屬植物葉片主脈的橫切面解剖特征1～4.均等型（1.香堇菜；2.紫花地丁；3.長(zhǎng)萼堇菜；4.七星蓮）；5～8.不等型（5.灰葉堇菜；6.雙花堇菜；7.早開(kāi)堇菜；8.南山堇菜）；C.晶體；E.表皮；Ph.韌皮部；Pp.柵欄組織；Sp：海綿組織；T.毛被；Xy.木質(zhì)部Plate Ⅳ Cross sections of leaf midrib in eight Viola species1-4.Equa（l1.Viola odorata；2.V.philippica；3.V.inconspicua；4.V.diffusa）；5-8.Unequal（5.V.delavayi；6.V.biflora；7.V.prionantha；8.V.chaerophylloides）；C.Crystal；E.Epidermis；Ph.Phloem；Pp.Palisade parenchyma；Sp.Spongy parenchyma；T.Trichome；Xy.Xylem

3.4 8種堇菜屬植物的葉柄橫切面解剖特征

8種植物的葉柄橫切面均由表皮層、厚角組織和維管束組織構(gòu)成（圖版Ⅴ）。表皮細(xì)胞較小、排列整齊，構(gòu)成閉合結(jié)構(gòu)，外壁有薄角質(zhì)層。表皮內(nèi)有4～10 層薄壁細(xì)胞構(gòu)成的厚角組織，細(xì)胞大小不一、排列疏松，有明顯胞間隙。主維管束位于中央，其形態(tài)與葉柄橫切面形態(tài)相似。葉柄兩側(cè)近軸面有明顯延伸生長(zhǎng)的突起，構(gòu)成帶有1對(duì)側(cè)生維管束的側(cè)翼。比較分析結(jié)果表明，葉柄橫切面輪廓、兩側(cè)近軸面的側(cè)翼突起、主維管束形態(tài)和側(cè)生維管束在同種植物里有一定的相關(guān)性，但在種間區(qū)別較大。葉柄橫切面形態(tài)輪廓在8個(gè)種間差異明顯，可分為3 類（表3）：橢圓形、近圓形和圓形。橢圓形，指橫切面較薄，其輪廓與主維管束的都呈橢圓狀，近軸面表皮平直或中央微隆，無(wú)凹陷，遠(yuǎn)軸面為半弧形曲線；葉柄兩側(cè)外緣處帶1對(duì)具次生維管束的延伸側(cè)翼（圖版Ⅴ：1～4）；見(jiàn)于長(zhǎng)萼堇菜、七星蓮、早開(kāi)堇菜和紫花地丁4 種。近圓形，指橫切面較厚、近餅狀，輪廓與主維管束的呈近圓形或深U 型（圖版Ⅴ：6～8），近軸面兩側(cè)有1 對(duì)具側(cè)生維管束的側(cè)翼突起，與中央的突起構(gòu)成了帶有1 對(duì)側(cè)翼的3 個(gè)脊?fàn)盥∑穑▓D版Ⅴ：6～8），見(jiàn)于灰葉堇菜、南山堇菜和香堇菜等3 種。圓形，指葉柄橫切面厚，近軸面兩側(cè)有次生維管束不明顯的側(cè)翼突起，中央隆起呈短弧形，與遠(yuǎn)軸面的長(zhǎng)弧形連接成帶1 對(duì)側(cè)翼圓周，與中央的圓形維管束構(gòu)成同心圓或環(huán)形，只見(jiàn)于雙花堇菜（圖版Ⅴ：5）。較為特別的是，該種的主維管束形態(tài)完整，呈閉合環(huán)狀，但韌皮部細(xì)胞出現(xiàn)分化，將其平分為4瓣，具有染色較淺的髓部。

表3 8種堇菜屬植物葉中脈和葉柄的橫切面解剖特征Table 3 Cross-sectional anatomical features of leaf and petiole in eight Viola species

3 討論

本研究觀察的云南常見(jiàn)8種堇菜屬植物，分別來(lái)自2 亞屬5 組［2］，包括二裂花柱亞屬的短距堇菜組（灰葉堇菜和雙花堇菜）和堇菜亞屬的4組，即合生托葉組（Sect.Adnatae）（長(zhǎng)萼堇菜、紫花地丁、早開(kāi)堇菜）、蔓莖堇菜組（Sect.Diffusae）（七星蓮）、裂葉堇菜組（Sect.Pinnatae）（南山堇菜）、堇菜組（Sect.Viola）（香堇菜）。圍繞著堇菜屬存在的組間分類和物種鑒定困難，本研究討論了它們的葉形態(tài)和解剖特征的分類學(xué)意義。

3.1 堇菜屬區(qū)域內(nèi)種間的葉型變化，可用于當(dāng)?shù)匚锓N鑒定參考依據(jù)

長(zhǎng)期以來(lái)，堇菜屬的組和亞組的劃分依據(jù)主要是花形態(tài)特征變異，尤其是柱頭和花柱特征是主要的分類學(xué)依據(jù)［8］。在野外，堇菜屬的花柱是否彎曲、柱頭孔大小和位置等有分類學(xué)意義的顯微特征不容易觀察，導(dǎo)致了物種鑒定相對(duì)困難［3-4］。為此，本研究討論了云南8種常見(jiàn)植物的葉形態(tài)分類學(xué)意義。首先，雙花堇菜和灰葉堇菜均見(jiàn)于海拔2 000 m 以上的高山草地，花期相同，均為黃花，屬于二裂柱頭亞屬的短距組，野外不易區(qū)別，兩者僅在葉形態(tài)區(qū)別明顯。雙花堇菜的葉型多為寬卵形或腎形，其基部為深心形或心形；灰葉堇菜的葉片為三角狀寬卵形，其葉基為淺心形或截型。其次，堇菜亞屬的合生托葉組的3種（長(zhǎng)萼堇菜、紫花地丁和早開(kāi)堇菜），由于同具紫花、葉型相似，常被列為近似種，甚至合并為紫花地丁一個(gè)種［2，24］。但在野外，長(zhǎng)萼堇菜為寬卵形葉，葉緣具粗齒、葉基心形、葉尖明顯；早開(kāi)堇菜寬卵形葉，近橢圓形，葉緣具細(xì)齒、葉基弧心形，葉尖不顯著；紫花地丁葉片為狹卵型，僅長(zhǎng)披針形，足以和前2 種區(qū)別。因此，這3 個(gè)種不宜合并，支持前人的觀點(diǎn)［2］。此外，深裂葉片和腎形葉在云南常見(jiàn)的堇菜屬里較為少見(jiàn)，在當(dāng)?shù)乜梢宰鳛槲锓N鑒定依據(jù)。深裂葉片是南山堇菜所在的裂葉堇菜組的主要分類學(xué)依據(jù)，稀不裂［2-3］。該組在我國(guó)有8 種，大部分都分布在東北，云南只有1 種，為羽裂堇菜（V.forrestiana），分布在滇西北和藏東南高山草地，但該種的葉片為三角狀卵形或狹卵型，只在葉緣處有羽狀淺裂［26］。同時(shí)，在國(guó)產(chǎn)的裂葉堇菜組的8 個(gè)種里，南山堇菜的三深裂葉片且開(kāi)白花的形態(tài)特征也較為獨(dú)特［2-3］。因此，對(duì)于云南常見(jiàn)堇菜屬植物的物種鑒定而言，看到三深裂的羽狀裂片葉，就可以將其初步判斷為南山堇菜。腎形葉見(jiàn)于堇菜組的香堇菜，雖分布在歐洲、北非和西亞等地，但由于具有較高觀賞價(jià)值，被廣為栽培，其腎形葉或近圓形葉在園藝堇菜植物里也較為獨(dú)特且少見(jiàn)。因此，腎形葉是香堇菜的物種鑒別特征之一。當(dāng)然，葉型在物種多樣性較高的堇菜屬里變異較大，部分種類由于生境不同而產(chǎn)生了不同的變型或亞種，值得進(jìn)一步研究。但在部分地域范圍內(nèi)、具明顯地理分布格局的堇菜屬區(qū)系范圍，種間的葉型變化可作為云南常見(jiàn)種或近似種的鑒定依據(jù)之一［26］。

圖版V 8種堇菜屬植物葉柄橫切面解剖特征1～4.橢圓形（1.長(zhǎng)萼堇菜；2.紫花地??；3.早開(kāi)堇菜；4.七星蓮）；5.近圓形（雙花堇菜）；6～8.深U 形（6.灰葉堇菜；7.南山堇菜；8.香堇菜）；E.表皮；Lvb.側(cè)生維管束；Pi.髓部；Ph.韌皮部；Xy.木質(zhì)部Plate V Cross section of leaf petiole in eight Viola species1-4.Elliptica（l1.V.inconspicua；2.V.philippica；3.V.prionantha；4.V.diffusa）；5.Orbicula（rV.biflora）；6-8.Deep-U shape（6.V.delavayi；7.V.chaerophylloides；8.V.odorata）；E.Epidermis；Lvb.Lateral vascular bundle；Ph.Phloem；Pi.Pith；Xy.Xylem

3.2 堇菜屬毛被特征和長(zhǎng)度在種間的變化，可作為物種劃分依據(jù)

關(guān)于堇菜屬毛被特征的分類學(xué)意義，研究資料較少。早期研究表明，堇菜屬的葉毛被類型為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞毛或單列毛，并指出在葉緣有鋸齒的種類里，其葉緣處的毛被為粗糙的腺體毛［29］。后來(lái)的研究也陸續(xù)證實(shí)了堇菜屬的葉表皮毛普遍為單細(xì)胞毛，上下表皮毛被的有無(wú)及其分布特征都用于物種鑒定。例如，南京產(chǎn)的紫花堇菜（V.grypoceras）和球果堇菜（V.collina）的下表皮都密被單細(xì)胞毛［30］；東北產(chǎn)的27種堇菜屬植物里，除香堇菜為2 細(xì)胞單列毛外，其余26 種都為單細(xì)胞毛［25］；伊朗產(chǎn)的3 個(gè)近緣種（香堇菜、白花堇菜V.alba&V.sintenisii）也都具有單細(xì)胞毛［16］。本研究觀察的8種植物的葉表皮毛被類型都為單細(xì)胞毛，沒(méi)有觀察到單列毛，也未在葉緣有鋸齒的種類里看到葉緣處的有腺體毛。值得注意的是，伊朗產(chǎn)的香堇菜單細(xì)胞毛只分布在上表皮，被列為區(qū)分近似種的鑒定依據(jù)［16］。該種的毛被特征與本研究觀察的云南產(chǎn)的香堇菜一致。如上所述，單列毛在堇菜屬里較為少見(jiàn)，只在堇菜組的球果堇菜觀察到2細(xì)胞單列毛［24］，目前尚未有其他類型的單列毛的資料。有意思的是，球果堇菜產(chǎn)自東北的植株有2 細(xì)胞單列毛，但長(zhǎng)在南京的個(gè)體，其毛被為單細(xì)胞長(zhǎng)柱狀毛，且較為密集［30］。此外，香堇菜也屬于堇菜組，但無(wú)論是產(chǎn)自伊朗或生長(zhǎng)在云南的植株，其毛被都為單細(xì)胞毛。顯然，毛被類型在堇菜屬的分類學(xué)意義，需要更多新資料佐證。

如上所述，堇菜屬的毛被類型和分布在種間差異明顯，可作為物種劃定依據(jù)。然而，毛被長(zhǎng)度在種間的變化和分類學(xué)意義，鮮有人關(guān)注。遼東地區(qū)的15種堇菜屬植物的毛被長(zhǎng)度在種間差異明顯［31］，但缺乏深入研究的數(shù)據(jù)。本研究觀察到毛被長(zhǎng)度在8種植物里區(qū)別明顯，將其分為3 類，即：短柱狀毛、中柱狀毛和長(zhǎng)柔毛。其中，最容易鑒別的是短柱狀毛，其長(zhǎng)度僅為60 μm 左右，基部寬、頂部銳，狀如寬短刺或盾鱗片，長(zhǎng)度不及中柱狀毛和長(zhǎng)柱狀毛的十分之一，而后者為基部寬而頂部尖的長(zhǎng)單細(xì)胞毛。短柱狀毛較少，僅見(jiàn)于具腎形葉的香堇菜（堇菜組）和具羽狀深裂葉的南山堇菜（裂葉堇菜組）。其次，中柱狀毛集中出現(xiàn)在堇菜亞屬的合生托葉組的3 個(gè)種，而蔓莖堇菜組（七星蓮）上表皮為長(zhǎng)柱狀毛，下表皮為中柱狀毛。這意味著長(zhǎng)柱狀毛也許可以作為合生托葉組的分類學(xué)依據(jù)之一。同樣地，二裂柱頭堇菜亞屬的灰葉堇菜和雙花堇菜各具長(zhǎng)柱狀毛和中柱狀毛，兩類毛被的長(zhǎng)度相差近4 倍，較容易區(qū)別。因此，毛被長(zhǎng)度在種間的差異，可以作為物種鑒定依據(jù)。

3.3 堇菜屬的葉表皮細(xì)胞類型和氣孔形態(tài)可區(qū)別近似種

首先，堇菜屬的葉表皮細(xì)胞形態(tài)和垂周壁樣式在種間差異明顯，多數(shù)為不規(guī)則型和淺波狀或深波狀，少數(shù)為多邊形和平直-弓形［24，29］。本研究觀察的8種植物，表皮細(xì)胞不規(guī)則型帶波狀垂周壁的出現(xiàn)在堇菜亞屬的3 組5 種（南山堇菜除外），多邊形和平直-弓形表皮細(xì)胞見(jiàn)于3 種，即二裂柱頭亞屬的雙花堇菜、灰葉堇菜和南山堇菜。目前，關(guān)于葉表皮細(xì)胞類型的分類學(xué)意義，僅見(jiàn)于近似種間的劃分［25］。本研究觀察的近似種，如雙花堇菜和灰葉堇菜雖然在葉型上區(qū)別明顯，但葉表皮細(xì)胞形態(tài)差異也可將其分開(kāi)，即：雖然它們的上表皮都為多邊形，但后者的下表皮為不規(guī)則深波狀，可以將2種分開(kāi)。在長(zhǎng)萼堇菜、紫花地丁和早開(kāi)堇菜這3個(gè)近似種的鑒定里，前者上下表皮為淺波狀與后2 種的深波狀區(qū)別明顯。紫花地丁的上下表皮皆為深波狀，但早開(kāi)堇菜的上表皮為淺波，下表皮為深波，也可作為鑒定參考依據(jù)。

其次，堇菜屬的氣孔普遍見(jiàn)于上下表皮，下表皮比上表皮常見(jiàn)，氣孔呈橢圓形，或近圓形，氣孔器類型普遍為不等型或橫列型等［15，29，30］。本研究觀察的8 種植物，除了南山堇菜的上表皮無(wú)氣孔外，其余上下表皮都有不等型氣孔，在灰葉堇菜和七星蓮還兼具平列型、橫列型或不等型。除長(zhǎng)萼堇菜和香堇菜的氣孔為圓形外，其余6種都為橢圓形。顯然氣孔形態(tài)在種內(nèi)比較穩(wěn)定，在種間差異明顯，可用于物種劃分。例如，根據(jù)氣孔形態(tài)，可以把長(zhǎng)萼堇菜與其近似種（紫花地丁和早開(kāi)堇菜）區(qū)別開(kāi)來(lái)，前者具圓形氣孔，后兩種為橢圓形氣孔。然而，氣孔器類型在同種和不同種植物里變化較大，氣孔密度和氣孔指數(shù)雖然種間也有差異，但難以比較其在種間或組間的分布規(guī)律，更多的與物種適應(yīng)環(huán)境相關(guān)［28］。不過(guò)，也有研究認(rèn)為，氣孔類型可以作為堇菜屬的組間界限劃分依據(jù)。例如，以三色堇為代表的美麗堇菜亞屬的氣孔類型為圍繞型，以雙花堇菜為代表的二裂柱頭亞屬為極細(xì)胞型；裂葉堇菜組不具有四細(xì)胞型氣孔器，因此支持其獨(dú)立為組［23］。顯然，僅以1個(gè)物種為代表來(lái)探究氣孔類型在組間的分類學(xué)意義有其局限性，仍需更多資料來(lái)支持。

3.4 堇菜屬葉中脈橫切和葉柄橫切面結(jié)構(gòu)特征的種間異同可用于討論近似種的關(guān)系

葉中脈和葉柄橫切面輪廓、主維管束形態(tài)、次生維管束數(shù)目和晶狀體的有無(wú)等特征在同種植物里是相對(duì)穩(wěn)定而恒定的，具有重要的物種鑒定意義［32-34］。但關(guān)于堇菜屬的葉中脈和葉柄橫切面解剖特征的分類學(xué)研究的資料較少，本研究初步分析如下。

首先，關(guān)于葉中脈處結(jié)構(gòu)特征的分類學(xué)意義有兩點(diǎn)值得說(shuō)明。第一，早期研究記錄了堇菜屬的部分種類葉中脈橫切面柵欄組織化不明顯，但在夏威夷分布的種類里分化為形態(tài)顯著的柵欄和海綿組織［19，30］。該柵欄組織分化不明顯的葉解剖特征，在伊朗產(chǎn)的堇菜屬植物里也普遍［15］，本研究觀察的云南產(chǎn)的8個(gè)種的柵欄組織也不明顯，說(shuō)明該特征值得繼續(xù)關(guān)注。第二，堇菜屬的葉中脈橫切面的上下表皮突起在種間多為凸起型，少數(shù)為平直型，可用于伊朗產(chǎn)的堇菜屬近似種和亞種間的區(qū)別［16］。然而，他們觀察的8 種植物都為凸起型，沒(méi)觀察到平直型，且葉中脈處的上下表皮突起在同種植物也有差異，可分為均等型和不等型，在種間差異明顯，但對(duì)此沒(méi)有深入分析［16］。本研究觀察到的同種植物上下表皮突起是否等大的特征，可以較好地用于物種鑒定。例如：均等型突起出現(xiàn)在堇菜亞屬的3 個(gè)近似種（香堇菜、紫花地丁和長(zhǎng)萼堇菜）和七星蓮。這證實(shí)了3個(gè)近似種在葉形態(tài)解剖特征方面具有相似性，但3種的主維管束的形態(tài)又各有不同，可以相區(qū)別，支持其為獨(dú)立的近似種，并與七星蓮還有一定的相關(guān)性。反之，不等型上下表皮突起見(jiàn)于其余4 種。雖然它們的主維管束都為典型的新月形，但各有區(qū)別。例如，除南山堇菜外，其余3 種的下表皮突起大于上表皮；雙花堇菜和灰葉堇菜的維管束形態(tài)為近圓形，前者有大量的方形晶狀體，后者有稀疏星狀晶體；早開(kāi)堇菜單細(xì)胞毛。

其次，關(guān)于堇菜屬葉柄解剖特征的分類學(xué)意義，集中在葉柄橫切面及主維管束的形態(tài)、次生維管束數(shù)目、上表皮兩側(cè)的翼狀突起及中部的脊?fàn)钔黄饠?shù)目等在種間差別明顯［15-16，33］。與上述研究結(jié)果基本相似，本研究觀察的8種植物的葉柄橫切面均具有中央維管束和1 對(duì)帶次級(jí)維管束的兩側(cè)翼狀突起。但葉柄橫切面和中央維管束形態(tài)相關(guān)，基本為橢圓形、近圓形和圓形等，在種間差異較大，可作為近似種之間的分析［16］。例如，雙花堇菜和灰葉堇菜這對(duì)近似種，兩者區(qū)別明顯，前者葉柄橫切面為圓形，后者呈具有缺口的近圓形。值得關(guān)注的是，雙花堇菜的葉柄解剖特征很特別，主維管束形態(tài)為閉合狀圓形，其中央分化出髓，這在現(xiàn)有資料里都是極少見(jiàn)的，值得進(jìn)一步研究。不過(guò)，堇菜亞屬的3個(gè)近似種（早開(kāi)堇菜、長(zhǎng)萼堇菜和紫花地?。┖推咝巧彛哂邢嗨频娜~柄橫切面形態(tài)，均為橢圓形和具月牙形主維管束特征。因此，結(jié)合它們?cè)谌~中脈橫切面解剖特征的相似性，進(jìn)一步說(shuō)明了這3個(gè)近似種為有近緣關(guān)系的獨(dú)立種，同時(shí)還與七星蓮有一定的親緣關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

再次，關(guān)于堇菜屬的葉片晶狀體的形態(tài)及其分類學(xué)意義資料較少。早期研究記錄了堇菜屬的葉肉和葉柄含有大量的單獨(dú)或成簇的晶狀體［16，21，25］；在伊朗產(chǎn)的物種里，星狀或方形的晶狀體也普遍見(jiàn)于不同種，可作為屬下分組的依據(jù)［15-17］。但本研究在8種植物的葉中脈和葉柄橫切面結(jié)構(gòu)上，僅在雙花堇菜發(fā)現(xiàn)有密集的方形晶狀體，在灰葉堇菜和香堇菜的葉中脈和葉柄橫切面上有稀疏分布的晶體。

綜上所述，堇菜屬的葉型態(tài)、表皮毛被類型、葉表皮細(xì)胞形態(tài)、氣孔形態(tài)和氣孔器類型、葉中脈和葉柄橫切面解剖特征在種間差異明顯，可用于屬內(nèi)物種鑒定及近似種的劃分［28-29］。根據(jù)葉形態(tài)、葉中脈和葉柄橫切面解剖特征，編制了云南常見(jiàn)8種堇菜屬植物的分類檢索表，具體如下。

8種堇菜屬植物檢索表-主要根據(jù)葉形態(tài)解剖特征

Key to eight Viola species mainly based on the morpho-anatomy of leaf

1.花黃色。………………………………………………………………………………………………………………………………………（2）

1.花白色或紫色?！?）

2.卵形葉；葉下表皮細(xì)胞為不規(guī)則型，垂周壁深波狀；長(zhǎng)柱狀毛；中脈處上下葉表皮突起為均等型，葉片??；葉柄橫切面近圓形，主維管束深U型……………………………………………………………………………………………………………………………灰葉堇菜V.delavayi

2.腎形葉；葉下表皮細(xì)胞多邊形，垂周壁平直弓形；中柱狀毛；中脈處上下葉表皮突起為不等型，葉片厚；葉柄橫切面圓形，主維管束圓型……………………………………………………………………………………………………………………………………雙花堇菜V.biflora

3.花白色；葉片三全裂………………………………………………………………………………………………南山堇菜V.chaerophylloides

3.花紫色，葉片非三全裂。………………………………………………………………………………………………………………………（4）

4.戟形葉……………………………………………………………………………………………………………………長(zhǎng)萼堇菜V.inconspicua

4.卵形葉。………………………………………………………………………………………………………………………………………（5）

5.葉上下表皮細(xì)胞形態(tài)相同；葉中脈處上下表皮突起均等型?！?）

5.葉上下表皮細(xì)胞形態(tài)不同；葉中脈處上下表皮突起不等型。………………………………………………………………………………（7）

6.葉片?。欢讨鶢蠲?；葉柄橫切面半圓形，主維管束深U形……………………………………………………………………香堇菜V.odorata

6.葉片厚；中柱狀毛；葉柄橫切面橢圓形，主維管束淺U形………………………………………………………………紫花地丁V.philippica

7.葉上表皮細(xì)胞垂周壁式樣不規(guī)則淺波，下表皮為不規(guī)則深波狀………………………………………………………早開(kāi)堇菜V.prionantha

7.葉上下表皮細(xì)胞均為不規(guī)則深波狀……………………………………………………………………………………………七星蓮V.diffusa