分子輔助篩選特異茶樹種質(zhì)資源的研究進展

李 慧，崔清梅，張 強，梁金波

(恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施445000)

種質(zhì)資源是植物進行品種創(chuàng)新和研究利用的基礎(chǔ)，也是對珍稀資源、特異資源保護的基礎(chǔ)．中國是世界茶樹的起源中心［1］，在世界生產(chǎn)茶葉的國家中，中國的茶園面積最為廣大，種質(zhì)資源最為豐富． 為了更好的發(fā)現(xiàn)和保護利用這些茶樹種質(zhì)資源，我國已建成世界上遺傳多樣性最豐富的國家種質(zhì)杭州茶樹圃，并將進行鑒定評價所取得的數(shù)據(jù)錄入“國家農(nóng)作物種質(zhì)資源圃信息系統(tǒng)”［2］．但是，隨著茶樹無性系良種繁殖的大力推廣，以及城市化建設(shè)等現(xiàn)代化事業(yè)的進行，許多種質(zhì)資源特別是特異的種質(zhì)資源正在大幅度減少，甚至即將消失，我國茶樹種質(zhì)資源面臨著嚴(yán)重的問題．于是，對我國特異的茶樹種質(zhì)資源進行有目的收集，并從根本上弄清其特異性，從而有針對性而高效的對其進行保護和利用，成為了目前亟待解決的問題．對此，各地的茶樹研究者非常重視特異茶樹種質(zhì)資源的篩選與利用［3－4］．先后選育出安吉白茶、黃金芽、紅碎茶［5］、高EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)含量［6］、不含咖啡堿［7］、高咖啡堿、抗寒［8］等具有特異性的茶樹種質(zhì)資源．

傳統(tǒng)的茶樹種質(zhì)資源篩選及鑒定工作主要依賴于形態(tài)學(xué)的調(diào)查和生理生化成分分析而進行，缺乏客觀性，且存在周期長，易受環(huán)境因素影響，等．近年來，隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子標(biāo)記技術(shù)和輔助手段越來越多的應(yīng)用在篩選特異的茶樹種質(zhì)資源上，并得到了一系列化學(xué)成分、外觀品質(zhì)、逆境和抗蟲等相關(guān)的特異茶樹種質(zhì)資源．本文論述了國內(nèi)外運用分子手段輔助篩選這些特異的茶樹種質(zhì)資源的研究進展，以期為進一步研究和發(fā)掘茶樹良種提供依據(jù)，為更好的保護利用茶樹種質(zhì)資源打下基礎(chǔ)．

1 低咖啡堿、高兒茶素茶樹種質(zhì)資源

茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、維生素、茶葉皂苷和茶氨酸等多種有效成分，具有抗菌、抗氧化、防癌、降低膽固醇等功能．其中咖啡堿含量一般為鮮葉干重的2%～4%，對茶湯滋味的形成有重要作用．但是由于容易引起心悸、失眠、焦慮等不良反應(yīng)，常常給神經(jīng)衰弱者、心血管疾病患者和孕婦等特殊人群造成困擾，而大大減少了此類消費群體［9］．為此，研究者開始研究和尋找具有低咖啡堿含量的茶樹種質(zhì)資源，試圖尋找與咖啡堿相關(guān)的基因．文海濤以南昆山毛葉茶的春季嫩稍為材料，篩選出了低咖啡堿含量的單株，然后通過構(gòu)建南昆山毛葉茶的cDNA 文庫和運用同源探針雜交篩選的方法克隆并獲得了咖啡堿合成過程中的兩個關(guān)鍵酶:NMT5(N－甲基轉(zhuǎn)移酶)和NMT7．在對這兩個基因進一步的表達分析中還發(fā)現(xiàn)，無論是南昆山毛葉茶還是英紅九號，這兩個茶樹品種中的NMT 基因表達都是春茶高于秋季，芽頭＞第一葉＞第二葉＞第三葉，這說明，春茶中的芽茶是低咖啡堿茶葉的最佳來源［10］． 張廣輝［11］則通過表達茶樹TCS(咖啡因合成酶)基因的發(fā)夾RNA(hpRNA)，利用RNAi 誘導(dǎo)的基因沉默的系統(tǒng)傳遞性來抑制茶樹葉片和芽中TCS 基因的表達，進而抑制咖啡因的生物合成，降低其含量，從而為今后獲得低咖啡因茶樹育種材料做基礎(chǔ)．

茶多酚也是茶樹中主要的次生代謝產(chǎn)物之一，其含量可達鮮葉干重的18%～36%，具有抗氧化和清除自由基、抗輻射和抵御紫外線的功能，對茶葉的色、香、味品質(zhì)的形成有重要作用［12］．其中兒茶素占茶多酚總量的70%～80%，而屬于酯型兒茶素的EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)是綠茶的主要活性成分和茶葉具有抗癌功效的核心成分［6］．Singh 等［13－14］先后從茶葉中克隆出C4H、ANS、CHS、DFR、F3H、4CL、CHI、F3’5’H、LCR、ANR 等調(diào)控兒茶素苯丙烷合成途徑的基因．楊冬青［15］則通過建立兩株生長形態(tài)和兒茶素含量均不同的愈傷組織差異表達的cDNA－AFLP 文庫，得到了與茶樹兒茶素相關(guān)的主要預(yù)測基因:咖啡酸O－轉(zhuǎn)甲基酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因、UDPG:花青素3’－O 型葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、CsMYBl 轉(zhuǎn)錄因子基因、CsMYB2轉(zhuǎn)錄因子基因、CsWD40 重復(fù)蛋白和2，4－D 可誘導(dǎo)的谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶基因，并發(fā)現(xiàn)隨著鮮葉成熟度的變化，這些基因的表達規(guī)律并不相同．

2 葉色變異的茶樹種質(zhì)資源

茶樹的芽葉顏色是決定茶葉的加工工藝以及影響茶葉品質(zhì)的主要因素之一，因此，篩選在顏色上具有特異性的茶樹資源也是目前研究的熱點之一．

眾所周知，MYB 蛋白是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，廣泛參與植物的逆境脅迫、細胞分化、葉片形態(tài)形成以及次生代謝調(diào)控等生物過程．而R2R3－MYB 型是MYB 蛋白中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，主要參與植物花青苷的代謝調(diào)節(jié)［16－17］．在對茶樹特異資源“龍井紫芽”遮陰處理后，比較新生芽葉中花青素含量及R2R3－MYB型轉(zhuǎn)錄因子基因的表達變化發(fā)現(xiàn)，遮陰處理能降低茶樹新梢中的花青素含量并改變芽葉顏色，同時CsMYB1的表達也出現(xiàn)明顯的增加，說明CsMYB1 的表達可能與茶樹花青素含量變化有一定的相關(guān)性．該研究還分離克隆出另一個轉(zhuǎn)錄因子WD40，但是它是否通過某種方式共同調(diào)控茶樹花青素的代謝還有待進一步的研究［18］．另外還有研究發(fā)現(xiàn)，茶樹資源產(chǎn)生特異葉色的原因，除了是呈色物質(zhì)葉綠素、花青素含量以及比例發(fā)生了變化外，可能還與植物的葉綠素代謝有關(guān)．陳林波等在特異茶樹品種“紫娟”中篩選到的差異表達基因中也包含了多個與葉綠素代謝相關(guān)的基因，如NADPH－原葉綠素酸酯氧化還原酶(POR)、葉綠素A/B 結(jié)合蛋白、Mg－原卟啉Ⅸ單甲基酯環(huán)化酶等，其中POR 在幼嫩葉片中上調(diào)表達．該研究還獲得1 個與肉桂酰輔酶A 還原酶同源的基因片段，該基因在成熟葉片中上調(diào)表達．因此，推測可能是肉桂酰輔酶A 還原酶跟查爾酮合成酶競爭相同的底物香豆酰輔酶A，而使成熟葉片中類黃酮代謝受到抑制，導(dǎo)致花青素的合成減少．另外在幼嫩葉片還獲得1 個與細胞色素P450 蛋白同源的片段，該蛋白在植物類黃酮代謝途徑中起著至關(guān)重要的作用，能催化羥基化、脫烷基、環(huán)化以及轉(zhuǎn)移作用．這些可能是幼嫩葉片比成熟葉片紫的另一個原因［19］．這些分子片段都為進一步利用及創(chuàng)造葉色變異的茶樹種質(zhì)資源提供了方向及基礎(chǔ)．

3 耐旱抗寒等抗逆境的茶樹種質(zhì)資源

各種逆境條件是植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會遇到的情況，面對逆境，植物自身的保護機制會發(fā)生一系列的生理代謝反應(yīng)和特殊生化過程，使代謝和生長發(fā)育受到可逆性的抑制，但是情況嚴(yán)重時會引起不可逆的傷害，導(dǎo)致植株直接死亡．對于茶樹這種經(jīng)濟作物來說，干旱、鹽漬、低溫等脅迫因素成為嚴(yán)重限制茶樹分布區(qū)域并影響茶葉產(chǎn)量的重要因素之一．因此，篩選能抵抗不同逆境的茶樹種質(zhì)資源也成為研究熱點．

研究者發(fā)現(xiàn)，色素不僅在維持葉色、花色方面起重要作用，作為一種次生代謝產(chǎn)物，有些色素還在植物的抗逆性中起作用．有的研究發(fā)現(xiàn)，隨著茶樹種質(zhì)資源的水分脅迫程度的加重，花青素含量呈逐漸增加的趨勢，并且與之合成相關(guān)的苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性也呈上升趨勢［20］，但在Kashmir Singh 等［21］對茶葉的實驗中卻發(fā)現(xiàn)，花青素還原酶(CsANR)的表達在干早脅迫下呈下調(diào)表達．類似的，在陳盛相等［22］的實驗中，與色素較接近的基因片段N3－5 也是隨著干旱脅迫時間的延長表達量卻逐漸降低．

產(chǎn)生結(jié)果不一致的主要原因可能是由于植物抗性機理并不是單個基因表達所能完成的，而是多個基因協(xié)調(diào)表達的結(jié)果［23］．因此，同一個基因可能調(diào)控不同的逆境條件．比如在對獲得的茶樹多元醇轉(zhuǎn)運子基因片段CsPLt 進行分析時，發(fā)現(xiàn)該基因可受低溫、高鹽以及脫水等多種脅迫誘導(dǎo)，推測其在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［24］．類似的，茶樹的ERF 基因能被低溫、乙烯、脫水、高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)表達，特別是對低溫、乙烯處理響應(yīng)較為強烈．推測該基因在茶樹抗逆生理中，尤其是在抗寒分子機制中有著重要功能［25］．再有，在對耐旱品種UPASI－9 和干旱敏感品種TV2 進行分析后，研究者識別出了分別與細胞防御、細胞運輸和新陳代謝等有關(guān)的基因共49 個．進一步運用qPCR 技術(shù)進行檢測后，發(fā)現(xiàn)奇異果甜蛋白樣蛋白(CsTLP)、幾丁質(zhì)酶(CsCHT)和胚胎晚期豐富蛋白3(CsLEA3)是使植物更加耐旱并從干旱脅迫中恢復(fù)的關(guān)鍵基因［26］．

再如，利用DDRT－PCR 對不同抗寒性的茶樹進行研究時，與茶樹抗寒性有關(guān)的差異表達基因分別與具有單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和碳酸酐酶(CA)功能的nectarinⅢ、甘油磷酰膽堿雙酯酶磷酸二酯酶(GPX－PDE)家族蛋白、參與脂質(zhì)代謝主要酶之一的卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶蛋白(LCAT)家族、調(diào)節(jié)微管蛋白結(jié)構(gòu)的微管蛋白C 伴侶基因具有一定同源性，說明茶樹的抗寒性與這些蛋白具有一定的關(guān)系［27］．與茶樹冷響應(yīng)相關(guān)的基因還有CsICE1 和CsCBF1，且CsCBF1 在正常溫度(20℃)下并不表達，只有在較低的溫度(4℃)下才表達，這兩個基因的表達在茶樹中是保守的［28］．房婉萍等［29］則克隆了與冷脅迫有關(guān)的茶樹CsHl基因的全長DNA 序列，該基因含有2 個外顯子和1 個內(nèi)含子，其內(nèi)含子中存在TATA 的真核生物啟動子元件以及ABRE 等逆境激素應(yīng)答元件，推測CsHl 基因內(nèi)含子可能具有增強該基因轉(zhuǎn)錄及逆境應(yīng)答的作用．

還有的研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸過氧化物酶(APX)轉(zhuǎn)基因的正義表達也可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性． 在對不同茶樹品種萎凋過程中APX 基因的表達發(fā)現(xiàn)，APX 基因的表達量隨著萎凋時間的延長呈現(xiàn)出“升高一降低—再升高一再降低”的變化特點．而且，隨著萎凋時間的延長(18 h)，細胞中H2O2含量的增加，APX 基因的表達量也迅速增加;隨著萎凋時間的進一步延長(24、36 h)，APX 基因的表達量顯著下降［30］．

除了干旱和寒冷，光破壞也是植物的逆境之一．韋朝領(lǐng)等［31］克隆了光保護中的關(guān)鍵酶紫黃素脫環(huán)氧化酶(VDE)的全長cDNA，長度為1 632 bp．并發(fā)現(xiàn)其具有熱穩(wěn)定性，為從分子生物學(xué)角度研究和調(diào)控茶樹的葉黃素循環(huán)功能，進而提高其抗逆性奠定基礎(chǔ)［31］．由于植物對逆境的響應(yīng)是多方面、多途徑協(xié)調(diào)完成的，所以，要確切的了解茶樹在逆境時的具體調(diào)控途徑還需要進行進一步的克隆及功能分析．

4 抗蟲害的茶樹種質(zhì)資源

茶樹蟲害是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的主要原因之一，隨著我國各地茶樹蟲害的泛濫以及對農(nóng)藥和殺蟲劑的限制，近年來，從分子層面研究茶樹的抗蟲性成為研究者們的熱點之一．在韋朝領(lǐng)［31］的研究中，發(fā)現(xiàn)如果茶樹被茶尺蠖的取食誘導(dǎo)后，構(gòu)成光合生物內(nèi)周天線的重要的色素蛋白復(fù)合物植物光系統(tǒng)ⅡCP43 蛋白基因會上調(diào)表達，分析這是茶樹在受蟲害后，為了增加對蟲害的生態(tài)適應(yīng)性而進行的光合補償機制．同樣地，在該研究中，發(fā)現(xiàn)A45 編碼的蛋白和β－木糖苷酶同一性很高．而β－木糖苷酶可以參與分步水解β－櫻草糖苷生成揮發(fā)性苷元，從而對茶樹葉部病害產(chǎn)生抗性［32］．而且這些揮發(fā)性苷元同時也是茶園茶樹－害蟲－天敵間的化學(xué)通訊物質(zhì)，因為糖苷類香氣前體常常能夠引誘天敵昆蟲，從而導(dǎo)致茶樹對害蟲產(chǎn)生間接抗性．

在該研究獲得的20 個差異片段中，有2 個差異片段(A51 和M13)屬于未知功能蛋白．此外，有11 個差異片段沒有發(fā)現(xiàn)比對序列，可能是由于茶樹上對害蟲取食誘導(dǎo)的分子機制研究較少，也可能是所獲取的差異序列片段偏短，序列提供的信息相對較少，也可能是茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)所產(chǎn)生的獨特差異基因，還待進一步克隆和確認(rèn)［33］．但是這些研究也提供了從分子方面增加茶樹抗蟲性的可能．

5 展望

特異的茶樹種質(zhì)資源不僅是人們保護的對象，更是進行種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育的基礎(chǔ)．但隨著人口壓力、毀林開荒和經(jīng)濟建設(shè)等方面的原因，茶樹種質(zhì)資源仍在不斷喪失．再者，由于茶葉的經(jīng)濟效益，人們有意識地進行良種選育，并進行大幅度地?zé)o性繁殖，在提高產(chǎn)量、滿足人們各種需求的同時，使得種質(zhì)資源的遺傳多樣性的降低，對逆境的遺傳脆弱性升高［34－35］．使茶樹種質(zhì)資源向著單一化方向發(fā)展的趨勢，長久下去，不利于茶樹的種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育．過去，由于技術(shù)上的限制，人們只能從主觀意識強、缺乏統(tǒng)一規(guī)范的外觀性狀以及單純的檢測生化成分這些方法來了解并篩選茶樹種質(zhì)資源．近年來，隨著蛋白質(zhì)技術(shù)、分子技術(shù)的快速發(fā)展和更新，人們越來越多的嘗試從更根本、更確切的原因上尋找合適的茶樹種質(zhì)資源．為此，為了篩選出適合不同人群和需求的茶樹種質(zhì)資源，茶樹研究者進行了大量的研究和試驗，但是，目前對茶樹種質(zhì)資源的分子研究還處于起步階段，仍需作大量的工作，包括基因功能鑒定、基因分離和克隆、載體的構(gòu)建、目的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定等．但是相信隨著茶樹分子研究的深入，分子技術(shù)會為特異茶樹資源以及抗病蟲育種提供廣闊的應(yīng)用前景，為實現(xiàn)茶葉生產(chǎn)的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、無污染打好基礎(chǔ)．

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