放線桿菌生產(chǎn)琥珀酸的研究進展

范兆乾,劉 穎,劉均洪

(青島科技大學化工學院,山東青島266042)

放線桿菌生產(chǎn)琥珀酸的研究進展

范兆乾,劉 穎,劉均洪

(青島科技大學化工學院,山東青島266042)

總結(jié)了利用放線桿菌生產(chǎn)琥珀酸時,提高琥珀酸產(chǎn)量的主要途徑,并介紹了琥珀酸的回收方法。

琥珀酸;放線桿菌;提高產(chǎn)量;提純

琥珀酸可用作合成許多工業(yè)重要化學物的前體,包括己二酸、1,4-丁二醇、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、琥珀酸鹽和丁內(nèi)酯等。另外,越來越多的琥珀酸用于合成生物可降解聚合物,如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酰胺(Nylon○Rx,4)和各種綠色溶劑[1]。目前,大多數(shù)商業(yè)化的琥珀酸都是用石油原料化學合成的,成本很高,限制了其大規(guī)模應用。與以石油為基質(zhì)化學合成琥珀酸相比,利用可再生資源發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸不僅成本低得多,對環(huán)境也更友好。

適合高效生產(chǎn)琥珀酸的有機體包括真菌和細菌。S.cerevisiae是真菌中產(chǎn)琥珀酸效果最好的,能在酒發(fā)酵的過程中產(chǎn)生高濃度的琥珀酸。研究者對許多利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的細菌菌種進行了篩選和研究。反芻動物的瘤胃能預消化大分子糖類,其特殊的環(huán)境為厭氧及兼性厭氧菌提供了良好的繁殖代謝條件,許多共生微生物能夠很好地產(chǎn)生琥珀酸,放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)就是其中的一種,對它的研究也較深入。A.succinogenes是巴斯德氏菌屬,是從牛瘤胃中分離出的兼性厭氧菌,也是一種溫和的嗜高滲菌,對高濃度的葡萄糖有很好的耐性,利于發(fā)酵。

作者在此對放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸時,提高琥珀酸產(chǎn)量的主要途徑和琥珀酸的回收方法進行了總結(jié)。

1 提高琥珀酸產(chǎn)量的途徑

1.1 代謝途徑的研究

為提高琥珀酸的產(chǎn)量,有必要對放線桿菌發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的代謝途徑進行研究。Mc Kinlay等[2]利用13C原子標記分析代謝中間產(chǎn)物的位置研究琥珀酸代謝途徑,結(jié)果表明磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是代謝過程中一個重要的節(jié)點。PEP羧化作用是琥珀酸生成過程中一個重要的反應,并與CO2水平緊密相關(guān)。這是因為高濃度的CO2使得PEP更多地羧化成草酰乙酸,而不是轉(zhuǎn)化成丙酮酸鹽。實際操作中,提高CO2的濃度確實會提高琥珀酸的產(chǎn)量,另外提高還原劑(H2)濃度也會提高琥珀酸的產(chǎn)量。發(fā)酵過程中,產(chǎn)生1 mol的琥珀酸需要消耗2 mol的NADH,為維持氧化還原電位(ORP)的平衡,會同時產(chǎn)生乙酸和蟻酸等副產(chǎn)物,且不同的氧化還原電位產(chǎn)生不同的副產(chǎn)物。目前,關(guān)于ORP對琥珀酸產(chǎn)生的影響已經(jīng)有不少研究,但ORP對微生物生理的影響機制仍不清楚。Li等[3]以A.succinogenes NJ113為目標,調(diào)整ORP水平,發(fā)現(xiàn)在-350 m V時,琥珀酸產(chǎn)量最大(1.28 mol· mol-1)、產(chǎn)率最高(1.18 g·L-1·h-1),并證明ORP同代謝物分配、酶活性和NADH/NAD+密切相關(guān)。

1.2 選擇適宜的基質(zhì)

為提高琥珀酸產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本,發(fā)酵基質(zhì)的選擇是必須考慮的因素。實驗室所用的碳源都是比較純的糖類,要實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)必須選擇價廉且來源豐富的可再生資源,如糖蜜、淀粉和各種纖維素資源。Wan等[4]首次以干酪乳清為基質(zhì),利用A.succinogenes 130Z生產(chǎn)琥珀酸。Du等[5]先用真菌對小麥面粉進行發(fā)酵,再將發(fā)酵后的復合物作為A.succinogenes的底物。Jiang等[6]先水解用過的啤酒酵母,再以水解液作為原料,此法原料價格較低,且利用率較高。

Borges等[7]利用甘蔗渣纖維素水解液,得到產(chǎn)量22.5 g·L-1的琥珀酸。董晉軍等[8]利用甘蔗糖蜜,得到產(chǎn)量46.0 g·L-1的琥珀酸。我國是農(nóng)業(yè)大國,纖維素資源特別豐富,若能將此資源應用于琥珀酸生產(chǎn),將更利于實現(xiàn)工業(yè)化。我國科研工作者已經(jīng)開始從事這方面的研究,Li等[9]篩選的突變菌種M.JSTP就可利用秸稈水解液進行發(fā)酵,所得到的琥珀酸產(chǎn)量達56.0 g·L-1。

1.3 抑制副產(chǎn)物產(chǎn)生

副產(chǎn)物是影響琥珀酸產(chǎn)量的重要因素,主要有乙酸、蟻酸、乳酸、丙酸和丙酮酸等副產(chǎn)酸。細菌產(chǎn)乙酸的主要途徑是磷酸轉(zhuǎn)乙?；?乙酸激酶(PTAACK)途徑,而氟乙酸(鈉)是乙酸類似物,可經(jīng)PTAACK途徑被細菌不可逆地轉(zhuǎn)化為氟代檸檬酸而導致細菌細胞的死亡。因此,篩選對氟乙酸具有抗性的突變株,就可得到PTA-ACK途徑轉(zhuǎn)弱、乙酸積累降低的細菌菌株[10],據(jù)此可判斷其商業(yè)生產(chǎn)的可行性。美國密歇根生物技術(shù)協(xié)會(MBI)篩選出的A.succinogenes抗8 g·L-1氟乙酸的突變株,琥珀酸產(chǎn)量達110 g·L-1,是目前報道的最高產(chǎn)量[11]。A.succinogenes 130Z及其變種(FZ6、FZ9、FZ21、FZ45、FZ53)均對氟乙酸鹽有一定的耐性,相對其它已經(jīng)報道的琥珀酸生產(chǎn)菌種,它們能夠產(chǎn)生更多的琥珀酸,并且對高濃度的琥珀酸有更好的耐受性,但仍會產(chǎn)生各種副產(chǎn)酸。

考慮到混合酸的分離和純化成本,應通過優(yōu)化代謝和發(fā)酵條件,盡量減少或徹底避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生。如通過響應面分析法建立各因素與響應值之間的數(shù)學模型,較直觀地考察不同因素之間的交互作用,從而減少實驗次數(shù),提高效率,是培養(yǎng)基優(yōu)化的良好方法[12]。周彬等[13]利用響應面法優(yōu)化了CCMCC1593的發(fā)酵培養(yǎng)條件,產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了37.5%。在獲得大量數(shù)據(jù)后,可通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行分析。李興江等[14]通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),當CO2體積分數(shù)為62%、H2體積分數(shù)為5.4%、生物素微量濃度為7.8 mmol· L-1時,A.Succinogenes HF13發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸最高產(chǎn)量為75.8 g·L-1。

1.4 基因系統(tǒng)的研究

僅僅依靠優(yōu)化發(fā)酵條件,并不能得到足夠高的琥珀酸產(chǎn)量,還需要了解琥珀酸代謝過程中,各種酶的作用和碳原子的分配機制,這就使破譯A.succinogenes基因系統(tǒng)成為必要。目前,A.succinogenes的病原性仍在研究中。Mckinley等[15]首次利用生物技術(shù)詳細分析了A.succinogenes的基因序列,并驗證了巴斯德菌科致病基因。結(jié)果表明,A.succinogenes缺少完整的三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán),并且PEP羧化酶是唯一的PEP羧化的相關(guān)酶,同時,A.succinogenes缺少致病性,使得其應用于工業(yè)生產(chǎn)成為可能。

1.5 消除產(chǎn)物抑制

產(chǎn)物抑制是影響琥珀酸產(chǎn)量的主要原因之一。Wee等[16]研究表明,在搖瓶中A.succinogenes能產(chǎn)生74 g·L-1的琥珀酸,其中突變株FZH53的琥珀酸產(chǎn)量達到106 g·L-1,而在重復批次生物被膜反應器中琥珀酸產(chǎn)量僅為40 g·L-1。Li等[17]利用Logistic和Monod數(shù)學模型分析了E.coli和A.succinogenes的產(chǎn)物抑制動力學,發(fā)現(xiàn)蟻酸、乙酸、乳酸和琥珀酸的抑制濃度分別為8.8～17.6 g·L-1、10～40 g·L-1、9～18 g·L-1和10～80 g·L-1,當琥珀酸濃度為40 g ·L-1時,會明顯抑制A.succinogenes的生長和發(fā)酵。原因在于酸性產(chǎn)物積累會迅速改變發(fā)酵液的p H值,因此需向發(fā)酵液中添加堿來維持菌體生長環(huán)境的酸堿平衡。但若只用單一的中和劑來控制p H值,大量的金屬離子會造成菌體的絮凝,不利于生產(chǎn)。Wang等[18]向A.succinogenes ATCC55618的發(fā)酵液中添加組合中和劑——5 mol·L-1NaOH和40 g·L-1Mg-CO3調(diào)節(jié)p H值至7.5,琥珀酸產(chǎn)量達59.2 g·L-1,比單獨添加NaOH時提升了27.9%,并消除了細胞凝集。添加組合中和劑,也是提升琥珀酸產(chǎn)量的策略之一。

1.6 其它途徑

研究者不斷努力,尋求不同的途徑以提高放線桿菌產(chǎn)琥珀酸的途徑[19],尤其是利用代謝和基因工程工具,可控制目標產(chǎn)物的代謝途徑,減小甚至消除副產(chǎn)品的抑制作用等。

2 琥珀酸的回收方法

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)生物產(chǎn)品的典型流程是接種、發(fā)酵、產(chǎn)品回收、濃縮和純化,其中下游分離純化過程的成本占到總生產(chǎn)成本的60%[20],因此發(fā)展經(jīng)濟的提純方式是降低成本的關(guān)鍵。而在琥珀酸的提純過程中,其純化濃縮方法都比較成熟,如吸附、離子交換和結(jié)晶,已經(jīng)可以大規(guī)模應用于工業(yè)生產(chǎn),因此,將其與副產(chǎn)品有效分離回收就十分關(guān)鍵,目前琥珀酸的回收方法有沉淀法(氨沉淀法或鈣沉淀法)、膜處理法(如電滲法)和液液萃取法(如反應提取法)等。

2.1 沉淀法

Hermann等[21]采用鈣沉淀法,通過向發(fā)酵液中添加二氫鈣鹽,中和發(fā)酵液的同時使琥珀酸形成琥珀酸鈣而沉淀下來,然后過濾、硫酸酸化,再進行酸和堿的離子交換,最終將琥珀酸的純度提高到94.2%。鈣沉淀法有一定的純化效果,但不能完全去除蛋白質(zhì)。另外,由于大量消耗氫氧化鈣、生石灰和硫酸,并生成大量商業(yè)價值不高的硫酸鈣,提高了成本,因此鈣沉淀法難以應用于工業(yè)生產(chǎn)。

Yedur等[22]采用氨沉淀法,先用氨水滴定發(fā)酵液生成琥珀酸二胺,超濾除去雜質(zhì),再用硫酸二氫銨處理或者在低p H值下用硫酸處理得到琥珀酸沉淀,最后用甲醇溶解、重結(jié)晶,琥珀酸純度達93.3%。氨沉淀法純化效果好,副產(chǎn)物硫酸銨可循環(huán)利用,降低了成本,但目前該法僅用于實驗室,未能工業(yè)推廣。

2.2 電滲法

電滲法廣泛用于制藥和食品工業(yè)廢水處理,此方法是利用離子交換膜將離子化合物從非離子化合物中分離出來。放線桿菌發(fā)酵液中琥珀酸一般以琥珀酸鹽的形式存在,其它物質(zhì),包括糖類、蛋白質(zhì)類、氨基酸類,大多以非離子形式存在。商業(yè)用或特殊用途的琥珀酸是游離的琥珀酸,而不是鹽。因此,又發(fā)展了水裂解電滲法,即將發(fā)酵液電滲后,再用水裂解電滲膜除去大多數(shù)陽離子,從而獲得高純度的琥珀酸。為除去剩余的雜質(zhì)陽離子、陰離子和氨基酸離子,需要聯(lián)合陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂,進行進一步的純化。因此,盡管采用電滲法提純后,琥珀酸的濃度從51. 5%提升到79.6%,并完全去除了蛋白質(zhì)和鹽,但電滲過程中會損失40%的琥珀酸,雜質(zhì)乙酸的濃度也從13.2%增大到19.9%[23]。

2.3 反應提取法

反應提取法在常溫和常壓下進行,能耗低,被認為是一種有效而經(jīng)濟的純化方式。反應提取法是基于提取劑胺與被萃取羧酸的可逆性反應,有機酸溶于水相,提取劑胺溶于非水溶有機相,在兩相接觸的液面,根據(jù)酸的p Ka值和實際p H值,胺選擇性地與陰離子親密反應,形成的胺-酸復合物溶于有機相,從而達到提取效果。該法所用胺多為叔胺,有機溶劑多為乙醇、二甲苯、庚烷、煤油、二氯甲苯或硝基苯。Song等[24]利用三辛胺、1-辛醇反應系統(tǒng)提取琥珀酸,再經(jīng)真空過濾和結(jié)晶,提取率達99%。

Jun等[25]研究表明,要提高琥珀酸的提取率,必須控制p H值在4.2以下,因為此時大多數(shù)有機酸分子以未解離的形式存在,但雜質(zhì)酸和無機酸陰離子又會對提取率產(chǎn)生影響。為此,Huh等[26]逆向考慮,先通過反應提取法除去雜質(zhì)酸,再在低p H值條件下除去葡萄糖,最后蒸發(fā)結(jié)晶,琥珀酸的純度和總產(chǎn)率分別為99.8%、71.3%。

反應提取法還包括后續(xù)的相處理過程,即通過機械裝置混合離心而分離兩相。配備簡單液液離心器的完整反應提取法提取工藝,已在實驗室達到一定的規(guī)模,但整套提取工藝仍未能實現(xiàn)工業(yè)化。

2.4 預分散溶劑萃取法(PDSE)

預分散溶劑萃取法是基于分散相膠狀液體泡沫(CLAs)[27,28],這些微米級的顆粒表面為含表面活性劑的油相薄膜,內(nèi)部為溶有胺萃取劑的有機相。工作時,含琥珀酸的水相從柱頂端流入,分散相則以相同速率從柱底端注入,進行混合,由于這些微小顆粒具有巨大的傳質(zhì)面積和很高的傳質(zhì)效率,在不同的溫度、p H值和濃度下,目的酸通過液膜進入預分散萃取體系CLAs的油相。因此,此法只需很小的體積比就可達到很高的萃取率。預分散溶劑萃取法的提取能力與反應提取法相當,但是能耗更低、更經(jīng)濟。目前,預分散溶劑萃取法已經(jīng)成功應用于實驗室規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。

3 結(jié)語

A.succinogenes僅是琥珀酸生產(chǎn)菌中的一種,其相關(guān)研究雖然很多,但仍不透徹,還不能滿足大規(guī)模的工業(yè)應用。理想的產(chǎn)琥珀酸工程菌,應達到高產(chǎn)量、高產(chǎn)率,且沒有副產(chǎn)品。當然,這也需要優(yōu)化發(fā)酵條件,包括最廉價的碳源、最佳的生物量和生長條件,同時需選擇先進的提取純化工藝,從而降低總成本。總之,考慮到可再生資源的價格、潛在市場規(guī)模、對環(huán)境的影響、菌種改善、發(fā)酵及純化工藝的發(fā)展,未來的琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)前景光明。

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The Research Progress of Succinic Acid Production by Actinobacillus Succinogenes

FAN Zhao-qian,LIU Ying,LIU Jun-hong
(Chemical Engineering College,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

Succinic acid is an important chemical precursorl for food,chemical and pharmaceutical industry, and can be produced through biological process.Actinobacillus succinogenes is an important succinic acid production strain.This paper summarizes the major ways of increasing succinic acid production,and briefly introduces the recovery methods.

succinic acid;Actinobacillus succinogenes;increasing production;purification

TQ 921.7

A

1672-5425(2013)05-0001-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.05.001

國家杰出青年科學基金資助項目(12-1-3-45-nsh)

2012-12-27

范兆乾(1988-),男,山東濰坊人,碩士研究生,研究方向:藥物化學,E-mail:fan.1988@yahoo.com.cn;通訊作者:劉均洪,教授,E-mail:liujh@public.qd.sd.cn。