脊椎動(dòng)物父系基因組主動(dòng)去甲基化研究進(jìn)展

孫 冰，謝明樹，陳松林，趙 文

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連116023;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島266071)

在多細(xì)胞有機(jī)體的發(fā)育過程中，不同的細(xì)胞和組織需要基因表達(dá)的特異性編程?；虮磉_(dá)是由遺傳機(jī)制和表觀遺傳機(jī)制共同調(diào)控的。表觀遺傳包括對(duì)DNA本身的修飾(CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化)和/或與之有關(guān)蛋白的修飾(磷酸化，乙酰化和組氨酸甲基化)。這些修飾都可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因表達(dá)［1］。每種細(xì)胞都有其特有的表觀遺傳特征，這樣才可以使得基因同源的細(xì)胞具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。

1 DNA甲基化、去甲基化和遺傳外重新編程

DNA甲基化是在不同甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，從CpG二核苷酸的S-腺苷甲硫氨酸中轉(zhuǎn)移一個(gè)甲基基團(tuán)至胞嘧啶殘基C5位置上的過程［2-3］。CpG二核苷酸主要存在于與基因相關(guān)的CpG島中，并主要成簇存在于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域。通常認(rèn)為這些CpG島位于轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)，并且在復(fù)制起始中代表基因組印跡?；騿?dòng)子CpG二核苷酸的甲基化可能會(huì)抑制基因表達(dá)，這通常是通過干擾其與DNA結(jié)合蛋白的接觸，或使其與轉(zhuǎn)錄抑制因子MeCP2 的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的［3］。

DNA甲基化是研究最多的一種表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一［4］，通常具有抑制基因表達(dá)，使雌性X染色體失活，調(diào)控印記基因表達(dá)，使轉(zhuǎn)座因子沉默和調(diào)控組織特異性基因表達(dá)的作用［5］。在卵子與精子生成過程中，標(biāo)記與不同甲基化標(biāo)記等位的母系和父系基因?qū)τ谡{(diào)控印記基因的表達(dá)具有重要的作用［2］。例如，通過使其中一個(gè)X染色體失活并調(diào)控組織特異性基因表達(dá)，雌性哺乳動(dòng)物胚胎中DNA的甲基化對(duì)于調(diào)控X染色體的劑量上具有重要作用。DNA甲基化還有可能使轉(zhuǎn)座因子沉默，其中轉(zhuǎn)座因子對(duì)于保持染色體結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性具有重要作用［4］。對(duì)于基因甲基化狀態(tài)和與其表達(dá)相關(guān)性的研究結(jié)果表明，由于甲基化而升高或降低的基因轉(zhuǎn)錄水平完全取決于在甲基化過程中失活的是正向調(diào)控因子還是反向調(diào)控因子［6］。

DNA去甲基化過程一般認(rèn)為分為兩類，分別為主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化。主動(dòng)DNA去甲基化則需要特定的酶反應(yīng)，而被動(dòng)DNA去甲基化會(huì)抑制復(fù)制過程中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活力。這兩種去甲基化方式包括胞嘧啶取代5-甲基胞嘧啶(5-meC)，或直接去掉5-meC中的甲基基團(tuán)。被動(dòng)和主動(dòng)去甲基化相結(jié)合同樣也可以造成DNA去甲基化。在這種情況下，被動(dòng)去甲基化的產(chǎn)物是半甲基化的DNA，最后會(huì)變成5-MeC-DNA糖基化酶(5-MCDG)的底物。

在脊椎動(dòng)物早期全能胚胎和多能生殖細(xì)胞的DNA和組蛋白標(biāo)記中存在大量的遺傳外重新編程機(jī)制。脊椎動(dòng)物特定DNA甲基化圖式的產(chǎn)生和保持需要DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合順、反式調(diào)控子的去甲基化反應(yīng)之間復(fù)雜的相互作用。細(xì)胞多能性和胚胎中基因表達(dá)的正確起始都可能需要表觀遺傳重新編程。在脊椎動(dòng)物已分化的體細(xì)胞中，基因組中的甲基化圖式通常是穩(wěn)定的并可遺傳的。但在生殖細(xì)胞和植入前胚胎中，脊椎動(dòng)物基因組會(huì)經(jīng)歷一種全基因組范圍內(nèi)的甲基化重排過程，并且這兩個(gè)階段中出現(xiàn)的重排過程是不同的。在早期胚胎發(fā)育階段中，配子的甲基化標(biāo)記會(huì)被消除(即去甲基化過程)，取而代之的則是對(duì)胚胎發(fā)育和胚胎全能性具有重要意義的胚胎標(biāo)記［7］。由此，基因組經(jīng)歷了重新甲基化的過程，基因組DNA在特定的發(fā)育時(shí)間和在特異的位點(diǎn)上被甲基化，并在胚胎移植時(shí)建立了這兩種基本的體細(xì)胞甲基化圖式。DNA甲基化和去甲基化反應(yīng)對(duì)于正常胚胎發(fā)育和胚胎印跡所需的特異DNA甲基化圖式的形成具有重要作用。

2 父系基因組的主動(dòng)去甲基化過程

父系基因組中DNA去甲基化是由酶催化的主動(dòng)過程。受精時(shí)，父系基因組交換魚精蛋白和組蛋白，并且經(jīng)歷需組蛋白修飾的DNA去甲基化，而母系基因組的表觀遺傳特性看起來則比較穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，精子中高度甲基化的基因在受精后第一輪復(fù)制前就被去甲基化了，而來源于卵母細(xì)胞的母系等位基因則不受這種重新編程的影響，它們或者保持受精后原本甲基化的狀態(tài)不變，或者重新進(jìn)一步甲基化［17］。在植入前胚胎發(fā)育過程中，DNA去甲基化是被動(dòng)的并伴有組蛋白修飾的重組過程。在囊胚期首次出現(xiàn)了表觀遺傳標(biāo)記的不同。關(guān)于研究去甲基化過程的生化通路的研究結(jié)果表明，去甲基化或者是直接去除胞嘧啶核苷酸環(huán)C5位置上的甲基基團(tuán)的過程，這是一種真正的去甲基化;或者是去除整個(gè)胞嘧啶核苷酸的堿基(或核苷、或核苷酸)的過程，這是一種間接的去甲基化過程。在體外條件下，甲基結(jié)合域蛋白-2(MBD2)參與了5-甲基胞嘧啶中直接去除甲基基團(tuán)的過程，但在MBD2缺失的受精卵中，其父系基因組去甲基化的過程是正常的［8］。這是因?yàn)槿コ?-甲基胞嘧啶中的甲基基團(tuán)需要一種可以破壞C-C氫鍵的高能量，這個(gè)過程需要一系列生化反應(yīng)的參與，并且這種主動(dòng)去甲基化很可能是間接的。研究表明，這種間接去甲基化機(jī)制可能是通過一種堿基切除修復(fù)或核苷酸切除修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的;或者是由5-甲基胞嘧啶的脫氨基作用(通過脫氨基酶將5-甲基胞嘧啶中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶)引發(fā)［9］，接著由作為胸腺嘧啶DNA糖基化酶和甲基結(jié)合域蛋白-4(MBD4)的一些DNA糖基化酶的T:G錯(cuò)配的修復(fù)作用實(shí)現(xiàn)的。然而，在小鼠受精卵中，在父系基因組中觀察到的正常的主動(dòng)去甲基化過程是缺少M(fèi)BD4參與的［10］，其主動(dòng)去甲基化過程是由負(fù)責(zé)重新甲基化的Dnmt3a和Dnmt3b引發(fā)的。在缺失S-腺嘌呤L-蛋氨酸的情況下，這些酶可以將5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶［11］。

很多研究表明母系基因組的被動(dòng)去甲基化可能是由于缺乏甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，Dnmt1)造成的，但關(guān)于父系基因組去甲基化的機(jī)制還有很多方面不夠清楚。例如，去甲基化過程是否有序列偏好性，在使一些區(qū)域免受去甲基化的機(jī)制中是否需要一種特定的組蛋白修飾機(jī)制參與等問題。另外，關(guān)于生殖細(xì)胞中一些反映甲基化狀態(tài)的標(biāo)記的作用機(jī)制一直不夠清楚，比如著絲粒上或圍繞在著絲粒上的異染色質(zhì)，單拷貝印記基因，以及LAP逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的情況。研究PGC7/Stella-KO(knock out，簡(jiǎn)稱KO)小鼠的受精卵中兩種父系印記基因中出現(xiàn)的去甲基化現(xiàn)象的結(jié)果表明，最初位于卵質(zhì)的PGC7/Stella被轉(zhuǎn)移到了父系基因組中，從而保持了使這些印記基因的甲基化狀態(tài)。此外，在植入前胚胎的發(fā)育過程中，母系基因組和受精卵中Dnm1亞型對(duì)于基因組甲基化特征的保持具有重要作用。

3 母系基因組不需主動(dòng)去甲基化的可能原因

從目前對(duì)于DNA甲基化重新編程機(jī)制的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，父系與母系基因組中去甲基化機(jī)制的原因和過程是不同的。研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)卵母細(xì)胞可以使一個(gè)轉(zhuǎn)移的體細(xì)胞核主動(dòng)去甲基，這表明這種主動(dòng)去甲基化的活性更可能是存在于卵母細(xì)胞中的(而非精子中)。關(guān)于受精后只有父系基因組會(huì)立即啟動(dòng)主動(dòng)去甲基化機(jī)制的原理尚無定論，但目前有幾種可能的解釋。

1)在魚精蛋白與組蛋白轉(zhuǎn)換的過程中，裸露的父系基因組是可以接近去甲基化酶的。

2)通過特異性標(biāo)記的指引，推導(dǎo)去甲基化酶只對(duì)父系基因組感興趣并發(fā)生作用。由于多精入卵的小鼠和人類的受精卵中有許多雄性原核，許多研究結(jié)果都支持以上兩種假設(shè);而在孤雌生殖的，雌核發(fā)育的或三倍體的受精卵中，母系基因組也是沒有去甲基化現(xiàn)象的［12］。另外，牛的卵母細(xì)胞不會(huì)使體細(xì)胞核發(fā)生主動(dòng)去甲基化，但在轉(zhuǎn)移了體細(xì)胞核的受精卵中觀察到了主動(dòng)去甲基化。在小鼠的受精卵ROSI后則觀察到了父系基因組中主動(dòng)去甲基化的非正常圖式。

3)母系基因組受一定機(jī)制的保護(hù)，可以免受主動(dòng)去甲基化。研究表明，四周帶有甲基化組蛋白的母系基因組可能會(huì)保護(hù)它們免受不同的細(xì)胞質(zhì)中重排機(jī)制的影響，而壓縮包裝在乙?；说慕M蛋白中的父系基因組則使它們更易于接近可能的去甲基化酶從而發(fā)生作用［13］。組蛋白甲基化，特別是 H3K9me2，很可能是通過吸引組蛋白-1連接蛋白來保護(hù)母系基因組免受主動(dòng)去甲基化機(jī)制影響的［14］。然而，以下研究證明，組蛋白修飾機(jī)制并不是抵抗主動(dòng)去甲基化的最主要的保護(hù)機(jī)制。研究表明，小鼠和羊基因組的組蛋白修飾模式是相似的，但在父系基因組中去甲基化的狀態(tài)則是非常不同的［15］。在敲除了PGC7/Stella的小鼠受精卵的母系基因組中可以觀測(cè)到主動(dòng)去甲基化現(xiàn)象，而其組蛋白-3(H3K9meC)的甲基化水平與野生型小鼠的不相上下［16］?；谶@些結(jié)果可以推斷出，作為一種對(duì)胚胎早期發(fā)育有重要作用的母系因子，PGC7/Stella可使母系基因組不需主動(dòng)去甲基化。然而，通過記錄父系原核中發(fā)生主動(dòng)去甲基化時(shí)PGC7/Stella的位置，研究結(jié)果表明 PGC7/Stella不在父系原核中，由此推測(cè)PGC7/Stella可能與其他因素共同作用來參與保護(hù)母系基因組免受主動(dòng)去甲基化過程。

4 不同脊椎動(dòng)物的主動(dòng)去甲基化機(jī)制

近年來對(duì)于脊椎動(dòng)物DNA主動(dòng)去甲基化過程的機(jī)制和參與此過程的酶的研究一直從未間斷。脊椎動(dòng)物各物種基因組的DNA甲基化水平是不同的，這反映了各物種中發(fā)育動(dòng)力學(xué)的不同。在哺乳動(dòng)物中，以父系基因組甲基化水平對(duì)于母系基因組甲基化水平的相對(duì)指數(shù)(RM value)來看，物種間原核期受精卵的父系基因組主動(dòng)去甲基化過程的動(dòng)力學(xué)原理有很大的不同。這種變化性可能意味著父系基因組的主動(dòng)去甲基化過程并不是哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中所必需的，或者每個(gè)物種都有自己獨(dú)特的維持正常胚胎發(fā)育的生存策略。研究表明，小鼠受精卵的父系基因組經(jīng)歷了完整的主動(dòng)去甲基化過程(RM＜0.4)。受精后4 h或交配后10 h，小鼠受精卵的父系基因組就完全失去了甲基化標(biāo)記。相較于小鼠受精卵的情況來說，大鼠受精卵主動(dòng)去甲基化的進(jìn)程可能有著或多或少的延遲。研究表明IVF后10 h或交配后16 h，其相對(duì)甲基化水平有了顯著下降［17］。另外，利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法，研究發(fā)現(xiàn)LINI1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在小鼠胚胎植入前發(fā)育時(shí)期被去甲基化了，而腦池內(nèi)類型IAP逆轉(zhuǎn)錄重復(fù)序列的甲基化狀態(tài)則保持不變。由此推斷，IAP元件與基因組其他組分情況不同，其可以抵抗住去甲基化機(jī)制也許具有預(yù)防潛在位點(diǎn)不穩(wěn)定的功能。研究發(fā)現(xiàn)，在第一次有絲分裂時(shí)，雄性原核基因組在進(jìn)行復(fù)制壓縮時(shí)被檢測(cè)到了5mC陽性信號(hào)的殘留［8］。在胚泡期的中期分裂相中發(fā)現(xiàn)了帶標(biāo)記的帶著絲粒的異染色質(zhì)，這表明了在小鼠胚胎植入前期至少有甲基化活動(dòng)出現(xiàn)。

與鼠科動(dòng)物情況不同的是，兩棲動(dòng)物非洲爪蟾在受精后較短的一段時(shí)間內(nèi)，其父系基因組中的5-甲基胞嘧啶并不會(huì)主動(dòng)去甲基化。早期胚胎的卵母細(xì)胞和精子DNA的高度甲基化水平可以得以保持，但在隨后的卵裂發(fā)育階段中這種DNA的高甲基化水平會(huì)逐漸下降。所以，在中囊胚轉(zhuǎn)換期(MBT)和隨后的原腸胚形成期，非洲爪蟾基因組的甲基化水平是最低的。在非洲爪蟾囊胚和原腸胚期，Irina Stancheva等檢測(cè)到了單個(gè)基因啟動(dòng)子(TFI IIA，Xbra和c-Myc II)甲基化狀態(tài)的缺失，這些基因可以在MBT期時(shí)被激活。然而，重復(fù)序列、在MBT期時(shí)不活躍的基因或單個(gè)基因的編碼區(qū)的甲基化圖式不變。在缺失甲基轉(zhuǎn)移酶xDnmt1的胚胎中，甲基化啟動(dòng)子的發(fā)育上的程序化變化被破壞了，這可能是由于發(fā)生在這些胚胎中的基因表達(dá)圖式發(fā)生了改變。這些研究結(jié)果表明，在非洲爪蟾中，DNA甲基化對(duì)于調(diào)控在MBT期內(nèi)基因活化的時(shí)機(jī)方面有重要作用［18］。

利用斑馬魚胚胎，Kunal Rai等利用一種5-meC脫氨基酶(簡(jiǎn)稱AID，此酶可將5-meC轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶)和一種G:T特異性錯(cuò)配的胸腺嘧啶糖基化酶(Mbd4)相結(jié)合的方式為揭示體內(nèi)去除5-甲基化胞嘧啶(5-meC)機(jī)制的原理提供了重要依據(jù)。甲基化的DNA注射到斑馬魚胚胎中，激發(fā)胚胎產(chǎn)生了一種強(qiáng)烈的DNA去甲基化活性，此活性在去除AID或缺少Gadd45酶因子的情況下會(huì)有所降低。值得引起注意的是，在體內(nèi)過表達(dá)這種脫氨基酶/糖基化酶對(duì)(AID/Mbd4)可以引起大部分基因組以及注射進(jìn)入胚胎的甲基化的DNA片段的去甲基化作用，這很有可能是由于G:T錯(cuò)配的作用。敲除AID或Mbd4可以引起普通基因的一系列重新甲基化作用。另外，Gadd45可以促進(jìn)去甲基化作用和脫氨基酶/糖基化酶對(duì)的功能性的相互作用。5-meC去甲基化是一種耦合反應(yīng)，即AID使5-meC發(fā)生脫氨基作用，接著Mbd4在Gadd45的促進(jìn)下切除胸腺嘧啶來完成整個(gè)去甲基化反應(yīng)［19］。

綜上所述，脊椎動(dòng)物物種之間父系基因組去甲基化方式的不同可能是由于卵子胞質(zhì)去甲基化活力的不同。然而，即使是公認(rèn)的父系基因組部分去甲基化的綿羊、山羊和兔中，仍有一定比例的受精卵的父系基因組是完全去甲基化的。利用種間顯微授精的方法，綿羊受精卵可使小鼠精子染色質(zhì)中出現(xiàn)主動(dòng)去甲基化現(xiàn)象［20］。另外，不同物種中精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同可能是造成物種間父系基因組去甲基化方式不同的另一個(gè)原因。相對(duì)于綿羊、山羊和兔來說，小鼠和大鼠受精卵胚胎的基因組中經(jīng)歷了一種早期活化過程(由母系至父系的過渡過程)［21］，所以對(duì)于小鼠和大鼠來說，父系基因組的主動(dòng)去甲基化可能是保證胚胎基因組具有正常轉(zhuǎn)錄活性的一個(gè)重要原因。

5 影響主動(dòng)去甲基化的因素

目前普遍認(rèn)為，卵子的胞質(zhì)是導(dǎo)致父系基因組去甲基化的主要因素。卵細(xì)胞質(zhì)的功能可能會(huì)受到卵母細(xì)胞質(zhì)量或胚胎受精后早期培養(yǎng)條件的影響。研究表明，不論是體內(nèi)成熟的豬的卵母細(xì)胞，還是在胚泡破裂前在體內(nèi)成熟的、接著體外培養(yǎng)至細(xì)胞分裂中期-II期的豬的卵母細(xì)胞，它們支持父系基因組進(jìn)行主動(dòng)去甲基化的能力都比體外成熟的卵母細(xì)胞的高。在小鼠和大鼠中，體外培養(yǎng)來自體內(nèi)的受精卵會(huì)削弱其主動(dòng)去甲基化的能力［22］。

父系配子的性能也可能會(huì)影響主動(dòng)去甲基化的效率。研究表明，小鼠受精卵可以通過試管受精(IVF)，卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(ICSI)和圓形精子細(xì)胞顯微注射術(shù)(ROSI)等方式獲得［23］。在小鼠中，IVF和ICSI都不會(huì)影響主動(dòng)去甲基化的動(dòng)力學(xué)，但ROSI會(huì)使去甲基化過程不正常，例如去甲基化程度不足或引發(fā)重新甲基化。所以可以推測(cè)的是，父系配子的性能可能會(huì)影響主動(dòng)去甲基化的效率。此外，ROSI后胚胎發(fā)育不完整可能由于以下兩種情況，即父系去甲基化圖式不正常，或雄性原核的核原生質(zhì)中甲基化的染色質(zhì)定位不正常，而并非由于父系去甲基化不完全所致。另一方面，不論ICSI或ROSI技術(shù)成功誕生了多少后代，大鼠胚胎的體外生產(chǎn)都不如小鼠的有效。通過IVF和ICSI技術(shù)得到的大鼠受精卵中父系基因組中出現(xiàn)主動(dòng)去甲基化的時(shí)間基本相似，即受精后6～10 h，但相較于體內(nèi)受精的受精卵來說，去甲基化的程度較淺。然而，ROSI并不會(huì)使大鼠受精卵父系基因組的去甲基化程度減輕［24］。

另外我們應(yīng)該注意到，在牛這個(gè)物種上進(jìn)行的去甲基化研究都是利用源于體外成熟的以及體外受精的原核受精卵?？紤]到細(xì)胞質(zhì)的成熟狀態(tài)是不同的(可作為一種預(yù)測(cè)發(fā)育能力的參數(shù))，如果利用源于體內(nèi)的受精卵或選擇體內(nèi)成熟的卵子進(jìn)行受精來研究這個(gè)現(xiàn)象的話，得到的主動(dòng)去甲基化機(jī)制的結(jié)果可能會(huì)發(fā)生改變。例如，在豬中，在體內(nèi)受精卵中觀察到完全去甲基化現(xiàn)象，而在體外受精的受精卵中卻沒有觀測(cè)到去甲基化現(xiàn)象。

6 展望

本文綜述了脊椎動(dòng)物原核期受精卵中父系基因組的主動(dòng)去甲基化過程。其更加深刻的分子機(jī)制，脊椎動(dòng)物各物種間出現(xiàn)這種去甲基化現(xiàn)象差異(出現(xiàn)與否及程度不同)的原因，以及母系基因組與父系基因組對(duì)于主動(dòng)去甲基化的不同的反饋機(jī)制等問題仍待進(jìn)一步研究［25-26］。理解父系基因組主動(dòng)去甲基化的機(jī)制會(huì)使許多問題有所突破。例如，利用不成熟精細(xì)胞進(jìn)行的顯微授精的成功率較低［27］，或非正常的遺傳外重排機(jī)制引起體細(xì)胞核移植的成功率較低［28］。目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的研究中，轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合，外源基因穩(wěn)定表達(dá)和遺傳，胚胎發(fā)育異常等問題是轉(zhuǎn)基因研究有待克服的重點(diǎn)和難點(diǎn)。從外源基因表達(dá)的表觀調(diào)控機(jī)制(尤其是表觀遺傳重編程的異常現(xiàn)象)來看，在甲基化水平變化最強(qiáng)烈的配子形成和早期胚胎發(fā)育階段中，若去甲基化不足或過早進(jìn)行重新甲基化，都會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常甚至死亡。理解脊椎動(dòng)物父系基因組去甲基化的機(jī)制可以為解決轉(zhuǎn)基因克隆水產(chǎn)動(dòng)物中普遍存在的難點(diǎn)問題提供理論依據(jù)，有利于轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)的更好應(yīng)用。研究胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，對(duì)于優(yōu)化體外胚胎發(fā)育條件以及提高體外胚胎生產(chǎn)效率有著重要意義。

［1］Wu C，Morris J R.Gene，genetics and epigenetics:a correspondence［J］.Science，2001，293:1103-1105.

［2］Wilkins J F.Genomic imprinting and methylation:epigenetic canalization and conflict［J］.Trends in Genetics，2005，21:356-365.

［3］Meehan R R.DNA methylation in animal development［J］.Semin Cell Dev Biol，2003，14:53-65.

［4］Bird A.DNA methylation patterns and epigenetic memory［J］.Genes Dev，2002，16:6-21.

［5］Li E.Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development［J］.Nat Rev Genet，2002，3:662-673.

［6］Jones P A，Takai D.The role of DNA methylation in mammalian epigenetics［J］.Science，2001，293:1068-1070.

［7］Reik W，Dean W，Walter J.Epigenetic reprogramming in mammalian development［J］.Science，2001，293:1089-1093.

［8］Santos F，Hendrich B，Reik W，et al.Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo［J］.Dev Biol，2002，241:172-182.

［9］Morgan H D，Dean W，Coker H A，et al.Activation-induced cytidine deaminase deaminates 5-methylcytosine in DNA and is expressed in pluripotent tissue:implications for epigenetic reprogramming［J］.J Biol Chem，2004，279:52353-52360.

［10］Santos F，Dean W.Epigenetic reprogramming during early development in mammals［J］.Reproduction，2004，127:643-651.

［11］M tivier R，Gallais R，Tiffoche C，et al.Cyclical DNA methylation of a transcriptional active promoter［J］.Nature，2008，452:45-50.

［12］Xu Y，Zhang J J，Grifo J A，et al.DNA methylation patterns in human tripronucleate zygotes［J］.Mol Hum Reprod，2005，3:167-171.

［13］Morgan H D，Santos F，Green K，et al.Epigenetic reprogramming in mammals［J］.Hum Mol Genet，2005，14:R47-58.

［14］Santos F，Peters A H，Otte A P，et al.Dynamic chromatin modifications characterise the first cell cycle in mouse embryo［J］.Dev Biol，2005，280:225-236.

［15］Hou J，Liu L，Zhang J，et al.Epigenetic modification of histone 3 at lysine 9 in sheep zygotes and its relation with DNA methylation［J］.BMC Dev Biol，2008，8:60.

［16］Nakamura T，Arai Y，Umehara H，et al.PGC7/Stella protects against DNA demethylation in early embryogenesis［J］.Nat Cell Biol，2007，9:64-71.

［17］Zaitseva I，Zaitsev S，Alenina N，et al.Dynamics of DNA-demethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo and in vitro［J］.Mol Reprod Dev，2007，74:1255-1261.

［18］Stancheva I，El-Maarri O，Walter J，et al.Meehan，DNA methylation at promoter regions regulates the timing of gene activation in Xenopus laevis embryos［J］.Developmental Biology，2002，243:155-165.

［19］Rai K，Huggins I J，James S R，et al.Cairn，DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase，a glycosylase，and Gadd45［J］.Cell，2008，135:1201-1212.

［20］Beaujean N，Taylor J E，McGarry M，et al.The effect of interspecific oocytes on demethylation of sperm DNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:7636-7640.

［21］Memili E，F(xiàn)irst N L.Zygotic and embryonic gene expression in cow:a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species［J］.Zygote，2000，8:87-96.

［22］Gioia L，Barboni B，Turriani M，et al.The capability of reprogramming the male chromatin after fertilization is dependent on the quality of oocyte maturation［J］.Reproduction，2005，130:29-39.

［23］Ogura A，Ogonuki N，Takano K，et al.Microinsemination，nuclear transfer，and cytoplasmic transfer:the application of new reproductive engineering techniques to mouse genetics［J］.Mamm Genome，2001，12:803-812.

［24］Hirabayashi M，Yoshizawa Y，Kato M，et al.Dynamics of DNA demethylation in pronuclear-stage rat zygotes produced by IVF，ICSI and ROSI［J］.Exp Anim，2009，58:303.

［25］Hany A，Yusuke Y，Shinichi H.Active demethylation of paternal genome in mammalian zygotes［J］.J Reprod Dev，2009，55:356-360.

［26］Ooi S K，Bestor T H.The colorful history of active DNA demethylation［J］.Cell，2008，122(7):1145-1148.

［27］Miki H，Lee J，Inoue K，et al.Microinsemination with first-wave round spermatids from immature male mice［J］.J Reprod Dev，2004，50:131-137.

［28］Wakayama T.Production of cloned mice and ES cells from adult somatic cells by nuclear transfer:how to improve the cloning efficiency［J］.J Reprod Dev，2007，53:13-26.