幾種DNA分子標記技術及其在茶樹種質資源研究中的應用

晏嫦妤 李家賢 黃華林 吳華玲 喬小燕 何玉媚

（1.廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所，廣州 510640；2.廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣州 510640；3.華南農業(yè)大學食品學院，廣州 510642）

1974年，Grozdicker等［1］在鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體時，利用限制性內切酶酶解后得到的DNA片段的差異，首創(chuàng)了DNA分子標記。所謂分子標記是指根據基因組DNA存在豐富的多態(tài)性而發(fā)展起來的可直接反映生物個體在DNA水平上的差異的一類遺傳標記，它是繼形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記之后最為可靠的遺傳標記技術。DNA分子標記以DNA為表現形式，消除了環(huán)境的影響，不存在基因表達與否和組織器官特異性，因此已被廣泛應用于遺傳圖譜的構建、遺傳育種、基因定位、物種親緣關系等研究方面。本文綜述了近年來出現的幾種DNA分子標記——ACGM、SRAP、TRAP、SCAR、RSAP 及SCoT的原理、特點及其在茶樹種質資源研究中的應用，并對其在茶樹種質資源研究中的應用前景進行了分析。

1 幾種分子標記的技術原理和特點

1.1 擴增共有序列遺傳標記（Amplified consensus genetic markers，ACGM）

ACGM標記是Brunel等［2］于1999年依據模式植物擬南芥（Arabidopsis）與蕓薹屬（Brassica）物種間編碼序列的保守性，首次提出的能夠探知擬南芥和蕓薹屬間共有遺傳信息的一種新型分子標記。ACGM是建立在親緣關系較近的物種間同源基因中編碼序列（外顯子）存在高度保守性，而非編碼區(qū)（內含子）存在潛在多態(tài)性基礎之上的一種基于PCR 技術的分子標記。它以一種植物已知功能基因的保守編碼序列為依據設計簡并引物，而在另一種親緣關系較近、需探知基因功能的植物總DNA中進行同源序列擴增，并通過分析擴增產物來進一步確定功能相同基因（直向同源基因）的存在與否、拷貝分布、拷貝數多少以及序列間同源性等。它最大的優(yōu)點是探知新的功能基因而無需克隆，可以在很大程度上節(jié)省構建文庫和人工誘變突變體的時間，具有簡便、快捷的特點［3］。

1.2 相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）

SRAP標記是一種基于PCR的標記系統(tǒng)，是由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士［4］于2001年在蕓薹屬植物開發(fā)出來的。其原理是基于基因外顯子GC含量豐富，運用CCGG序列可特異性擴增出包含這些組分的序列。而啟動子和內含子AT含量豐富，可以與含有核心AATT序列的引物特異性結合。SRAP就是利用這一特點設計引物對基因開放閱讀框架進行擴增。SRAP標記技術結合了RAPD和AFLP兩者的優(yōu)點，具有簡便、穩(wěn)定、高重復性、易測序等特點，并且應用少量的引物便可組配得到多對引物，提高了引物使用效率，降低了引物合成成本。但是由于SRAP標記是對開放讀碼框進行擴增的，因而對基因組相對較少的著絲粒附近以及端粒的擴增會較少，可能使得所構建的連鎖圖譜縮短或出現連鎖群斷開的現象。如果結合可擴增這些區(qū)域的SSR標記，便可獲得覆蓋整個基因組的連鎖圖，更好地運用于基因分離鑒定及調控研究等方面［5，6］。

1.3 靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP）

TRAP是一種基于PCR技術的分子標記，是由美國農業(yè)部北方作物科學實驗室Hu與Vick［7］于2003年提出來的。TRAP技術是基于已知的cDNA或EST序列信息。目前已獲得許多物種基因組序列的豐富信息，包括人類、擬南芥，以及重要作物水稻和多種微生物的基因組序列草圖繪制成功，有大量的EST序列可供使用，從而使得可以利用生物信息學工具和EST數據庫信息產生出許多靶基因序列的TRAP多態(tài)性標記，而且極易將性狀與標記相關聯。TRAP由SRAP技術改進而來，該技術使用長度為16-20核苷的固定引物（fixed primer）與隨機引物（arbitrary prime），固定引物以GenBank中的靶EST序列設計而來；另一個為隨機引物，針對外顯子或內含子的特點，分別設計為富含GC或AT核心區(qū)的任意序列。通過對目標區(qū)域PCR的擴增，產生圍繞目標候選基因序列的多態(tài)性標記［8］。TRAP標記具有操作簡單、重復性高、穩(wěn)定性好、效率高等特點。而且，由于TRAP技術是基于已知的cDNA或EST序列信息，極易將龐大的EST序列信息和植物重要農藝性狀相聯系，在種質資源基因鑒定和作物理想農藝性狀基因標記上很有幫助。

1.4 序列特定擴增區(qū)域標記（sequence characterized ampli fied region，SCAR）

SCAR標 記 是Paran和Mihcelmore［9］建 立 的一種可靠、穩(wěn)定、可長期利用的標記技術，是在RAPD標記基礎上發(fā)展起來的。先用隨機引物對基因組DNA進行RAPD擴增，篩選特異片段，獲取特異的RAPD標記，進行克隆和測序，然后根據測序結果設計引物，對基因組DNA進行PCR特異擴增，這樣便將與原RAPD片段相對應的單一位點鑒別出來。SCAR標記技術對比RAPD技術有以下優(yōu)越性：（1）由于使用較長的特異性引物和較高的退火溫度，可有效解決RAPD標記結果不穩(wěn)定、重復性差等問題；（2）可將顯性的RAPD標記轉化為共顯性的SCAR標記，解決由于DNA降解對RAPD帶來的影響；（3）獲得的條帶單一，克服了RAPD標記的不穩(wěn)定和統(tǒng)計不便等缺點。因此，SCAR標記技術已成為轉化RAPD標記的一種穩(wěn)定可行的方法［10-12］。

1.5 限制性位點擴增多態(tài)性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）

RSAP為杜曉華等［13］建立的一種檢測基因組上廣泛分布的限制性酶切位點多態(tài)性的DNA分子標記系統(tǒng)。它的原理是采用2條長度均為18 bp的引物，引物的5'端為12-14個堿基的隨機序列，接著是4-6個堿基的限制性酶切位點序列，2條引物采用不同的限制性位點和隨機序列，PCR擴增程序借鑒了SRAP技術，前5個循環(huán)采用較低的退火溫度以保證擴增效率，隨后35個循環(huán)采用較嚴謹的退火溫度對已擴片段特異性擴增，以保證擴增產物的穩(wěn)定。擴增產物從6%變性聚丙烯酰胺凝膠中分離，銀染顯色。RSAP標記有以下優(yōu)點：（1）無需酶切，僅用一個簡單的PCR反應即可實現對DNA限制性位點多態(tài)性進行檢測，比以往基于限制性位點的標記技術操作更加簡便；（2）引物可以兩兩隨機配對，加上步驟較少，一定程度上降低了成本；（3）擴增的限制性位點散布于整個基因組區(qū)；（4）具有中等產率、穩(wěn)定可靠的特點和較廣泛的適用性。

1.6 起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）

SCoT分子標記技術是一種目標分子標記技術，是由Collard和Mackill［14］在水稻研究中提出的，其依據植物基因中的ATG 翻譯起始位點側翼序列的保守性，設計單引物并對基因組進行擴增，擴增產物用簡單的瓊脂糖分離檢測。引物設計是SCoT標記的核心。一系列研究表明，基因的起始密碼子的附近序列非常保守，具有一致性。SCoT標記的引物就是根據植物基因中的ATG翻譯起始位點側翼區(qū)域的保守性來設計的。在SCoT標記中的單引物與RAPD、ISSR單引物的作用幾乎相同，同時充當上下游引物，不同的是SCoT單引物可同時結合在雙鏈DNA的正負鏈上的ATG翻譯起始位點區(qū)域，從而擴增出兩結合位點之間的序列。SCoT分子標記作為一種新型分子標記有幾大特點：（1）建立在PCR基礎上的單引物擴增，操作簡單，易于各種物種SCoT標記技術體系的建立；（2）和ISSR標記相比，它是一種目的基因分子標記，能有效產生和性狀連鎖的標記，方便分子標記輔助育種；（3）使用了較長的引物長度，理論上比RAPD標記重復性好；（4）引物設計簡單，可在原有引物序列基礎上做少許改動來設計更多新引物，設計好的SCoT標記引物可以在物種間通用。

2 幾種分子標記在茶樹種質資源研究中的應用

分子標記對于研究茶樹的遺傳多樣性和鑒定優(yōu)質品種資源具有重要作用。多種分子標記如RFLP、RAPD和AFLP等已經應用于茶樹種質鑒別，遺傳多樣性分析，遺傳穩(wěn)定性和遺傳作圖等領域。目前，上述新型分子標記技術在植物分類學［15］、遺傳多樣性［16］、遺傳圖譜構建［17］和輔助育種［18］等方面的研究廣為應用，但在茶樹種質資源方面的研究應用較少，主要集中在遺傳多樣性及特異標記方面。

沈程文等［19］采用表型鑒定與SRAP分子標記，對25份廣東茶樹種質和5份對照品種的遺傳多樣性進行系統(tǒng)評價和分類，表明21對SRAP引物共擴增出127條帶，其中114條為多態(tài)性帶，占88.67%；平均每個引物組合的譜帶數和多態(tài)性帶數分別為6.05條和5.43條，當遺傳距離為0.39 cm時，茶樹種質可分成A、B、C 3類，其中A類占83.33%；當遺傳距離為0.31 cm時，又可將A群劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個亞群，其中第Ⅰ亞群包括13個品種，第Ⅱ亞群包括2個品種，第Ⅲ亞群包括10個品種。該研究證實了SRAP分子標記在檢測茶樹種質資源多態(tài)性方面具有較高的效率，并且該分子標記是針對開放閱讀框進行擴增，增加了擴增結果與表型性狀的相關性。

唐玉海［20］利用TRAP技術對16個茶樹品種進行研究，從35對TRAP引物組合中，選用了18對多態(tài)性較好的組合，總共產生了72條條帶，其中多態(tài)性條帶56條，占總條帶的77.78%，條帶大小大約在100-800 bp，平均每個引物擴增4條，多態(tài)性最高為100%，最低為33%。說明該標記能有效地應用與茶樹種質資源遺傳多樣性的分析。唐玉海等［20］還通過與抗旱相關的幾個基因設計引物，對擴增出的條帶進行聚類分析顯示，葉型較大，明顯不抗旱的云南大葉和優(yōu)10單獨聚為一類，而其余幾個葉型較小，抗旱性較好的品種聚為一類，初步揭示了種質的抗旱性差異。該項研究說明了TRAP分子標記能有效地將茶樹的有關性狀和分子標記關聯起來，在茶樹種質資源鑒定研究中具有較好的前景。

丁 洲 等［21，22］開 展 了 茶 樹 的RAPD標 記 向SCAR標記轉化的研究。結果表明，用SCAR引物擴增的DNA條帶清晰明顯，與RAPD相比，其對反應條件的敏感程度低。因此，特異性和重復性較好，是一種可以直接指導茶樹生產實踐的種質鑒定方法，解決了RAPD標記的不穩(wěn)定性和AFLP標記的繁瑣、高成本的問題，這也進一步證實了SCAR標記的優(yōu)越性。

劉循等［23］以局部發(fā)生的黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus（Quaintance）為對象，利用SCAR標記技術獲得了長度為987 bp的黑刺粉虱特異性片段（GenBank登錄號為FJ613323），根據此片段的堿基序列設計黑刺粉虱特異性引物1對（AS-F518/ASR938）。該研究以SCAR標記技術成功地將黑刺粉虱與其他種類的粉虱如桔綠粉虱、煙粉虱（B型、Q型、ZHJ-1型和ZHJ-2型）、溫室粉虱、螺旋粉虱等進行了有效區(qū)分，體現了其特異性。通過該項研究說明，SCAR分子標記技術有望在茶樹苗木調運的害蟲檢疫和監(jiān)測/檢測中得到實際應用。

3 幾種分子標記在茶樹遺傳育種中的應用前景分析

對于應用分子標記輔助育種的關鍵是要找到一些與性狀相關聯的標記，而TRAP標記是基于已知的cDNA或EST序列信息，極易將EST序列信息和植物重要農藝性狀相聯系。到2012 年6月12日為止，在GenBank的dbEST數據庫中登錄的茶樹ESTs已有28 794條，因此將TRAP技術應用在茶樹育種上找到一些與茶樹優(yōu)良性狀相關的標記，對加快茶樹優(yōu)良性狀的鑒定及品種選育具有重要意義。

隨著功能基因組學研究的深入和生物信息學的發(fā)展，目的基因分子標記和功能性分子標記越來越來受到研究者的重視，因其本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密聯鎖，這樣通過對某個分子標記的篩選即能對性狀進行篩選，從而加速育種進程［24］。近幾年，目的基因分子標記類型被廣泛開發(fā)并應用。SCoT標記技術是一種除SRAP、TRAP等標記外一種能跟蹤性狀的新分子標記技術，該技術已被成功應用于水稻［25］、花生［26］和龍眼［27］中。植物間基因功能的保守性決定了基因序列的保守性，利用功能基因保守序列開發(fā)出來的SCoT 標記可轉移性更強。來自單子葉植物（水稻）的SCoT 標記引物，在雙子葉植物花生中的擴增效果也很好，說明SCoT 標記可在不同物種間共用。因此，該技術有望在茶樹育種中得到應用，推動茶樹功能型分子標記的研究開發(fā)。

4 小結

各種DNA分子標記技術從誕生到發(fā)展至今都有其自身的優(yōu)缺點，在各自特定的領域中均具有不可替代的作用，雖然目前這些分子標記在茶樹種質資源研究中應用較少，但隨著茶樹分子生物學數據及資源的不斷增多加之生物信息學、基因芯片等新技術的不斷發(fā)展及其與分子標記技術的相互融合和相互滲透，DNA分子標記技術將在茶樹種質資源研究領域有更廣泛的用途和前景。如ACGM標記，能夠探知親緣關系較近的物種間的同源基因的功能，對于茶樹這種遺傳背景復雜，且基因序列研究較少的物種，可以通過一些和茶樹親緣關系較近且功能基因研究較多的物種進行ACGM標記，找到一些新的功能基因。

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