甘蔗轉(zhuǎn)基因育種研究進展

甘儀梅 張樹珍 曾凡云 馮翠蓮 楊本鵬

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所，儋州 571737）

甘蔗是世界熱帶和亞熱帶地區(qū)主要的糖料作物和能源作物。甘蔗為無性繁殖、非整倍體的高度多倍性，遺傳背景復(fù)雜，開花難，這增加了通過有性雜交育種進行品種改良的難度。同時，由于缺乏優(yōu)異農(nóng)藝性狀的育種親本，難以通過傳統(tǒng)的育種手段育成有突破性的優(yōu)異品種。通過基因工程技術(shù)，可以實現(xiàn)將目的性狀的定向轉(zhuǎn)移，如對甘蔗的抗蟲性、抗病性、抗逆性及蔗糖品質(zhì)甚至作為生物反應(yīng)器進行的遺傳改良，為甘蔗品種改良提供了有效的途徑。近10年來，甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展迅速，已獲得了一批改良不同性狀的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。本研究介紹近年來甘蔗轉(zhuǎn)基因使用的主要方法及安全性，以及針對不同農(nóng)藝性狀轉(zhuǎn)基因的研究現(xiàn)狀，為培育優(yōu)異的甘蔗品種打下基礎(chǔ)。

1 甘蔗轉(zhuǎn)基因策略及安全性

1.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

甘蔗為非整倍性的多倍體單子葉植物，基因組大，遺傳背景復(fù)雜，使得甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在低轉(zhuǎn)化效率等問題。基因槍法（微彈轟擊法）具有不受宿主限制、靶受體類型廣泛、可控度高和操作簡便快速的優(yōu)點，是甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)前期使用的主要轉(zhuǎn)基因方法［1-5]。然而，盡管基因槍法操作簡單，但是成本高、轉(zhuǎn)化效率低，表達不穩(wěn)定，阻礙其在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的廣泛應(yīng)用。而具有成本低、成功率高、導(dǎo)入的外源基因多為單拷貝，遺傳穩(wěn)定性好的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法在甘蔗轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中發(fā)展迅速［6-8]，目前已經(jīng)獲得了抗蟲、抗病、抗除草劑和改良糖分等性狀的轉(zhuǎn)基因植株。

轉(zhuǎn)化效率和再生過程是植物轉(zhuǎn)基因的主要難點，近年來有許多關(guān)于提高甘蔗轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化及再生的研究［9]。甘蔗外植體再生分為經(jīng)過愈傷階段的外植體間接再生［3，10，11]和不經(jīng)過愈傷階段的外植體直接再生［6]。Manickavasagam等［6]采用6個月大的甘蔗品種Co92061和Co671的腋芽與攜帶nptII、bar和gus的雙元載體的農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105進行共培養(yǎng)，不經(jīng)過愈傷階段，能夠在5個月內(nèi)獲得再生植株，轉(zhuǎn)化效率高達50%。此外，據(jù)報道，nptII（neomycin phosphotransferase II）（具有對卡那霉素的抗性）是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中最有效的標記基因［12，13]，共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮濃度和農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化效率有影響［6]。

1.2 轉(zhuǎn)基因表達及其穩(wěn)定性

在轉(zhuǎn)基因育種當中，最受關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因的表達及其穩(wěn)定性。影響甘蔗轉(zhuǎn)基因表達和穩(wěn)定的主要因素包括：選用的啟動子的強度；基因沉默和G+C含量和密碼子偏好等。到目前為止，應(yīng)用于甘蔗轉(zhuǎn)基因最多的啟動子為組成型的玉米ubi-1，但其在甘蔗不同器官中表達并不一致［14]。多倍體植物基因通常含有8-10個等位基因，給甘蔗啟動子的分離造成較大的困難，因此甘蔗啟動子克隆研究明顯滯后，相關(guān)報道不多。Damaj等［15]利用PCR擴增甘蔗BAC文庫分離到了甘蔗的與纖維生物合成相關(guān)的啟動子DIRIGENT基因。王正鵬［16]克隆了甘蔗己糖轉(zhuǎn)運蛋白PST2a基因的啟動子序列，命名為pPST2a，馬滋蔓［17]進一步構(gòu)建相關(guān)表達載體，通過GUS基因表達的檢測，證實了pPST2a具有根部特異表達特性。轉(zhuǎn)基因沉默是甘蔗轉(zhuǎn)基因中很容易出現(xiàn)的問題，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達不穩(wěn)定。轉(zhuǎn)基因沉默主要分為轉(zhuǎn)錄基因沉默（TGS）和轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。Ingelbrecht等［18]在大多數(shù)植株的CP轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域觀察到DNA甲基化增加，這些特性表明了RNA介導(dǎo)的同源機制是抗病毒的基本，這兩種沉默都已經(jīng)在甘蔗轉(zhuǎn)基因中有報道［19-21]。高G+C含量不僅可以提高基因表達量，還可以提高轉(zhuǎn)基因的表達穩(wěn)定性［3，4]。

1.3 安全的轉(zhuǎn)基因甘蔗培育

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物帶來了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益的同時，其安全性引起了全世界的關(guān)注。選擇標記基因的安全性是轉(zhuǎn)基因植物安全性的首要問題。目前提高選擇標記基因安全性的主要策略包括：（1）利用無爭議的生物安全性標記基因；（2）在轉(zhuǎn)化時使用標記基因，但獲得轉(zhuǎn)基因植株后將標記基因剔除；（3）選擇無標記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。使用無爭議的生物安全標記基因是目前文獻報道使用最多的標記系統(tǒng)［22]。與將抗性基因作為選擇標記時需要將非轉(zhuǎn)化細胞殺死而轉(zhuǎn)化細胞存活的負篩選系統(tǒng)，應(yīng)用與糖代謝相關(guān)的基因作為選擇標記可稱為正篩選系統(tǒng)。Jain［23]首次使用基于磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI，EC 5.3.1.8）/甘露醇的正篩選系統(tǒng)，將甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因CP在以甘露醇基因manA作為選擇標記，獲得了轉(zhuǎn)基因甘蔗植株，將這些轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過PCR和Southern blot 分析，結(jié)果顯示，有19株是manA陽性，15株是CP陽性，13株二者均陽性。

2 甘蔗轉(zhuǎn)基因育種研究

2.1 抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗研究

螟蟲是甘蔗生產(chǎn)中危害最嚴重的鉆蛀性害蟲。螟蟲鉆進莖內(nèi)取食，使化學(xué)農(nóng)藥防治效果有限，且缺乏較好的抗蟲品種，通過轉(zhuǎn)基因手段將對螟蟲有毒害的基因?qū)敫收嶂?，選育出抗蟲品種，將是控制螟害的經(jīng)濟有效的主要手段。甘蔗轉(zhuǎn)基因中使用的主要抗蟲基因為蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白（Bt）基因、蛋白酶抑制劑（PI）和植物凝集素相關(guān)基因等。

目前已經(jīng)從蘇云孢桿菌中分離到多個生產(chǎn)Bt毒素的Cry蛋白相關(guān)基因，并在50多種植物中應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲性研究，也是甘蔗抗蟲基因應(yīng)用最廣泛且最有潛力的基因。首次報道的轉(zhuǎn)基因抗蟲甘蔗是經(jīng)過修飾的抗甘蔗螟蟲（Diatraea saccharalis）的Cry1A（b）基因［24]。轉(zhuǎn)基因株系的Cry1A（b）蛋白表達量很低，可溶性葉片蛋白只有0.59-1.35 ng/mg，但是轉(zhuǎn)基因甘蔗節(jié)間螟蟲感染很低或中等，田間試驗中，這些轉(zhuǎn)基因株系的其他農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟性狀變異非常?。?4，25]。馮翠蓮等［26，27]構(gòu)建了玉米UBI啟動子分別驅(qū)動Cry1Ab和Cry1A（c）基因的表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗，分別獲得了22株和71株陽性植株。為提高Cry1Ac基因的表達量，Weng等［3]將其G+C含量從原來的37.4%提高到47.5%，通過玉米ubi-1啟動子驅(qū)動獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗，在每毫克轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片和蔗莖的總可溶性蛋白中，Cry1Ac的蛋白表達整分別為1-10 ng和0.2-0.6 ng，是Arencibia等［24]報道的7倍，并對我國主要螟蟲條螟（Proceras venosatus）具有較高的抗性。后來，Weng等［4]把G+C值提高到54.8%，Cry1Ac表達量再次提高，可達到2.2-50 ng/mg，比2006年所報道的提高了5倍，且對螟蟲的抗性也隨之提高［4]。這些研究表明了適合于甘蔗密碼子使用模式的較高的G+C含量能夠獲得更高的基因表達。Arvinth等［28]利用玉米ubi-1啟動子，將經(jīng)過密碼子修飾的Cry1Ab基因單個導(dǎo)入甘蔗或?qū)胍艳D(zhuǎn)胰蛋白酶抑制劑基因的甘蔗中，Cry1Ab基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗中獲得了較高的表達量，這歸因于單子葉特異啟動子和較高的G+C含量以及低拷貝轉(zhuǎn)基因。Cry1Ab基因表達量與二點螟（Chilo infuscatellus）引起的枯心率成負相關(guān)。在聚合雙基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗中的枯心率更低，表明了抑制劑基因與Cry1Ab基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗中存在協(xié)同效應(yīng)［28]。

磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）羧酶在C4植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯受光照的調(diào)控，并積累于葉肉細胞。以PEP-C啟動子調(diào)控的Bt δ-內(nèi)毒素基因?qū)氲礁收嶂?，甘蔗轉(zhuǎn)基因植株中δ-內(nèi)毒素自幼嫩葉片開始隨著細胞發(fā)育誘導(dǎo)積累，且轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出高抗枯心的特性，螟幼蟲在取食轉(zhuǎn)基因植株葉片1 h內(nèi)被殺死，且該蛋白沒有影響到蔗汁安全性［29]。

摻有大豆蛋白酶抑制劑（PI）的飼料能夠延緩甘蔗螟蟲（D. saccharalis）的生長發(fā)育［30]，因此Falco等［31]以玉米ubi-1啟動子驅(qū)動，將Kunitz胰蛋白酶抑制劑（SKTI）和大豆Bowman-Birk抑制劑（SBBI）相關(guān)基因?qū)敫收?，取離體的轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片喂養(yǎng)螟幼蟲，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)表達SBBI的轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片的螟蟲死亡率沒有明顯變化，但喂養(yǎng)表達SKTI葉片的螟蟲死亡率升高。Christy等［5]將編碼抑制甘蔗鱗翅目螟蟲的腸蛋白酶活性的抑肽酶的合成基因通過粒子轟擊轉(zhuǎn)移到2個甘蔗品種CoC 92061和Co 86032，通過分子鑒定的轉(zhuǎn)基因甘蔗的抑肽酶水平發(fā)生變化，在生測試驗中，喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因甘蔗的幼蟲的重量顯著降低，嚴重影響其生長發(fā)育。

雪花蓮凝集素（Galanthus nivalis agglutinin，GNA）是目前與害蟲治理相關(guān)且研究得比較深入的一種單子葉甘露糖結(jié)合凝集素，具有高度的特異性結(jié)合活性。劉曉娜等［32]將經(jīng)過人工改造的gna基因?qū)敫收?，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。Allsopp和McGhie［33]將雪蓮花凝集素和小麥胚芽凝集素摻入飼料飼養(yǎng)甘蔗的金龜子幼蟲，發(fā)現(xiàn)GNA和小麥胚芽凝集素對金龜子（Antitrogus parvulusBritton）幼蟲具有殺蟲活性以及抑制其生長發(fā)育的作用。Sétamou等［34]用將表達凝集素GNA的轉(zhuǎn)基因甘蔗對墨西哥水稻螟和小蔗螟生長發(fā)育的影響進行連續(xù)兩個世代的生物學(xué)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，墨西哥水稻螟的生長發(fā)育受到GNA的阻礙，但小蔗螟的生長發(fā)育沒有受到明顯影響。為研究表達GNA的抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗是否能夠通過人工喂養(yǎng)傳遞給螟蟲的天敵寄生蜂，并對寄生蜂的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，通過人工喂養(yǎng)試驗，結(jié)果表明，寄生蜂的生長發(fā)育由于取食墨西哥水稻螟而間接受到了轉(zhuǎn)基因甘蔗的微弱影響，但毒性不強［35]。人工飼喂含GNA的飼料或噴灑含GNA的藥水能顯著降低蚜蟲的存活率［36]。因此，利用韌皮部特異啟動子RSs-1或玉米ubi-1啟動子驅(qū)動GNA，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將GNA轉(zhuǎn)入甘蔗中，轉(zhuǎn)基因甘蔗中的蚜蟲密度降低了60%-80%，甚至達到95%，轉(zhuǎn)基因甘蔗能夠顯著降低甘蔗棉蚜（Ceratovacuna lanigera）的繁殖力和存活率，延緩其生長發(fā)育［12]。

2.2 抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗研究

白條?。╔anthomonas albilineans）是一種甘蔗細菌性維管束病害，葉片病斑呈乳黃色，縱剖莖可見節(jié)間有微小鮮明的黃色條紋，引起甘蔗減產(chǎn)，在我國福建、廣東等省均有發(fā)生。至今為止，抗細菌性病害的轉(zhuǎn)基因甘蔗研究主要是圍繞抗白條病（albicidin）進行。從防治白條病的細菌中克隆解毒基因albD，并使其在甘蔗中表達，獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株葉片中AlbD酶含量增加，接種甘蔗白條病菌后，轉(zhuǎn)基因甘蔗無葉灼癥狀，但未轉(zhuǎn)基因植株感病嚴重，表明轉(zhuǎn)基因植株對白條病的抗性顯著增強［37，38]。雖然育成品種對白條病均有一定的抗性，但未能得到完全抗白條病的品種。

目前，甘蔗抗病毒轉(zhuǎn)基因的研究主要是針對甘蔗斐濟病（FDV）和甘蔗花葉?。⊿CMV）這兩種影響較大的病害進行的。McQualter等［39]將玉米Ubi啟動子控制的來自人工合成甘蔗的斐濟病病毒（FDV）基因組片段轉(zhuǎn)入甘蔗Q124品種中，轉(zhuǎn)基因植株對FDV表現(xiàn)出不同程度的抗性，并獲得一個抗性明顯的株系。Ingelbrecht等［18]將高粱花葉病病毒SCH株系的外殼蛋白基因（CP）導(dǎo)入甘蔗，獲得了抗病毒轉(zhuǎn)基因植株。Butterfield等［40]將抗除草劑的bar基因和抗高粱花葉病病毒的hut基因?qū)敫收幔闷渑c未轉(zhuǎn)基因甘蔗雜交，Southern blot分析子代轉(zhuǎn)基因分離，生物學(xué)分析除草劑抗性和SrMV抗性，結(jié)果表明所有轉(zhuǎn)基因都插入基因組的同一個位點。接種SrMV結(jié)果表明有相當高比例的轉(zhuǎn)基因子代對花葉病敏感。由于對于抗病毒表型，轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制可能使轉(zhuǎn)基因在減數(shù)分裂中重新分配，因此基于成熟甘蔗的表型篩選比基于小苗的要更可靠。這是甘蔗轉(zhuǎn)基因分離的首個報道，轉(zhuǎn)基因親本穩(wěn)定遺傳的特性可用于育種當中。姚偉等［41]將甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因（SCMV-CP）導(dǎo)入到易感花葉病的拔地拉（Badila）甘蔗種中，獲得了53株抗性轉(zhuǎn)化幼苗。羅遵喜等［42]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將美洲商陸抗病毒蛋白基因PAP-c轉(zhuǎn)化我國主栽甘蔗品種ROC22，接種甘蔗花葉病毒的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株對甘蔗花葉病具有一定的抗性。由甘蔗黃葉病毒（SCYLV）引起的甘蔗黃葉病是葉片中脈變黃，進而葉片壞死和生長停止。Zhu等［43]將編碼SCYLV的外殼蛋白基因遺傳轉(zhuǎn)化感病品種（H62-4671），獲得了抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗，并分析了侵染后發(fā)病量，與未轉(zhuǎn)化易感病株系相比，9個轉(zhuǎn)基因株系中，有6個獲得低于10倍的感染率。通過侵染癥狀檢測其抗性水平，結(jié)果顯示這些具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株中其抗性與抗性品種（H78-4153）相似。

甘蔗黑穗病被稱為甘蔗的癌癥，是嚴重影響甘蔗產(chǎn)量和質(zhì)量的真菌性病害。幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖是許多真菌細胞壁的主要成分，能降解病原真菌的細胞壁，抑制病原真菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，進而抑制真菌的生長。顧麗紅等［44]將修飾過的幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的雙價抗病基因?qū)胛覈收醿?yōu)良品種ROC10和ROC22，將獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行抑菌試驗，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因甘蔗增強了對黑穗病的抗性?？兹剑?5]將在玉米和小麥中具有高抗黑穗病能力的KP4基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入甘蔗栽培品種ROC22號，獲得56株陽性轉(zhuǎn)基因植株，植株的葉片粗蛋白對黑穗病菌孢子萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制作用。沈林波［46]將具有廣譜抗菌性的紫花苜蓿防御素MsDef1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入甘蔗，對24株轉(zhuǎn)基因植株進行葉片粗蛋白體外抑菌檢測，獲得了7株對黑穗病菌核禾谷鐮刀菌均表現(xiàn)強烈抑制作用的轉(zhuǎn)基因植株，并通過田間接種試驗，篩選到抗病等級為2級的轉(zhuǎn)基因植株。

2.3 抗除草劑轉(zhuǎn)基因甘蔗研究

將除草劑解毒基因?qū)敫收嶂杏煽钩輨┢贩N，可以有效地使用除草劑進行蔗田除草，降低甘蔗生產(chǎn)的勞動強度和生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益。Falco等［47]利用基因槍法將bar基因?qū)敫收幔@得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甘蔗。Manickavasagam等［6]利用甘蔗腋芽通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得抗草丁膦除草劑的植株。Butterfield等［40]將抗除草劑的bar基因和抗高粱花葉病病毒的hut基因?qū)敫收?，使其與未轉(zhuǎn)基因品種雜交，后代發(fā)生性狀分離，其中大部分有bar基因整合的植株后代表現(xiàn)出對抗除草劑抗性。2003年Leibbrandt和Snyman［48]也獲得了抗除草劑草丁膦的轉(zhuǎn)基因甘蔗，他們將pat基因?qū)敫收酦Co310品種，轉(zhuǎn)入基因經(jīng)3次營養(yǎng)體繁殖仍能穩(wěn)定表達，其株高、莖徑、有效莖數(shù)、抗病性及產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀沒有發(fā)生改變，但對草銨膦除草劑具有抗性，用除草劑處理，其中有兩個株系的產(chǎn)量有所提高。

2.4 蔗糖改良的轉(zhuǎn)基因甘蔗研究

甘蔗的主要產(chǎn)品是糖，因此提高糖分及其品質(zhì)始終是甘蔗育種的主要目標。降低甘蔗的轉(zhuǎn)化酶活性可以提高蔗糖積累。Ma等［49]將甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)化酶的反義基因?qū)敫收?，抑制甘蔗酸性轉(zhuǎn)化酶活性，從而使得蔗糖積累量提高了2倍。Wang等［50]將通過葉肉細胞特異表達啟動子rbcS驅(qū)動無機焦磷酸酶PPi基因獲得的表達載體導(dǎo)入甘蔗中，轉(zhuǎn)基因甘蔗蔗莖中的蔗糖、果糖和葡萄糖的含量比對照植株分別提高了25%、39%和39%。

與提高糖分產(chǎn)量相比，遺傳改良更多的是蔗糖的純度、色澤等。Vickers等［51]將多酚氧化酶基因（PPO）的正鏈和反鏈及菠菜磷酸蔗糖合酶基因SPS的正鏈通過基因槍法導(dǎo)入甘蔗Q117品種，獲得了穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因株系，證實了甘蔗中多酚氧化酶（PPO）活性越高，蔗糖顏色越深，但其蔗糖色澤未得到改良。Groenewald等［52]在甘蔗中組成型表達反義和不可翻譯的焦磷酸鹽基因（PFP），降低其在甘蔗中的活性，轉(zhuǎn)基因株系的未成熟節(jié)間PFP活性降低，糖分積累顯著增加，有利于提高整株甘蔗蔗糖的純度。同樣，van der Merwe等［53]也是通過降低甘蔗中的PFP活性進而提高己糖磷酸鹽的含量，進一步促進未成熟節(jié)間的蔗糖的合成。Ferreira等［54]通過導(dǎo)入可降低AGPase活性和增加β淀粉酶活性的轉(zhuǎn)化載體，獲得了淀粉含量顯著下降而糖分沒有顯著變化的轉(zhuǎn)基因甘蔗。Hamerli等［55]將對嗜中酸假單胞菌MX-45'基因進行修飾合成的果糖合成酶相關(guān)基因在玉米泛素啟動子控制下表達，獲得生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)果糖和異構(gòu)蔗糖的轉(zhuǎn)基因甘蔗，使蔗汁中果糖含量增加，最高可達600 mmol/L，且果糖產(chǎn)量經(jīng)過多個營養(yǎng)世代仍然保持。

山梨醇是蔗糖合成過程的中間產(chǎn)物，不僅對糖分的形成有重要作用，還與抗逆性有相關(guān)。Chong等［56]將蘋果山梨醇-6-磷酸鹽脫氫酶基因mds6pdh導(dǎo)入甘蔗中，獲得積累與糖分合成和分解相關(guān)酶的山梨醇的轉(zhuǎn)基因甘蔗，甘蔗在每毫克轉(zhuǎn)基因葉片干重和莖干重中，山梨醇的表達量分別平均為120 mg和10 mg。轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片中與糖分合成和分解相關(guān)酶的酶活性水平提高，但沒有影響到蔗莖的糖分積累，只是對甘蔗是生長有一點影響。經(jīng)GC-MS檢測和配位體交換色譜法證實，其相關(guān)化合物為6-O-β-d-吡喃葡萄糖-D-山梨醇，或龍膽二糖［57]。

2.5 基于生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因甘蔗研究

甘蔗為C4植物，具有光合效率高、生物量大、宿根性好、轉(zhuǎn)基因安全性好等特點，且易于大面積種植、成本低、有自然的蛋白儲存器等優(yōu)點，因此可將甘蔗作為生物反應(yīng)器進行生物合成重組蛋白或生物塑料。目前以甘蔗作為生物反應(yīng)器主要有兩方面，一是生產(chǎn)醫(yī)藥重組蛋白，如人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等；二是生產(chǎn)具有塑料特性的聚羥基丁酸酯（PHB）。

人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）對人類骨髓細胞（TF-1）進行細胞分裂是必需的，具有良好的藥用價值。Wang等［58]將含GM-CSF基因的不同表達載體在不同啟動子調(diào)控下導(dǎo)入甘蔗中，獲得了代表約200個獨立株系的超過300個轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。GM-CSF蛋白的積累達總可溶性蛋白的0.02%，并且人類骨髓細胞能夠在添加轉(zhuǎn)基因甘蔗提取物的生長介質(zhì)中增殖，與商業(yè)化生產(chǎn)的GM-CSF功效一致。轉(zhuǎn)基因植株GM-CSF積累保持穩(wěn)定，這是利用甘蔗田間生產(chǎn)GM-CSF的首次報道。

McQualter等［59]利用來自天然植物中間體的兩個不同細菌蛋白（埃希氏桿菌屬大腸桿菌分支酸丙酮酸鹽裂解酶的葉綠體相關(guān)蛋白和來自假單胞菌酮基的4-氫化肉桂酰基-輔酶A水解酶/裂解酶）導(dǎo)入甘蔗，獲得了生產(chǎn)羥基苯甲酸的轉(zhuǎn)基因甘蔗。

已有研究表明，半胱氨酸蛋白酶的天然抑制子胱蛋白能夠抵抗昆蟲的為害。Ribeiro等［60]將玉米泛素啟動子調(diào)控的組氨酸標記的血管能抑素基因轉(zhuǎn)入甘蔗并使之表達，獲得了一株（HIS）CaneCPI-1表達量高的轉(zhuǎn)化甘蔗植株，轉(zhuǎn)基因葉片的粗提物能抑制從甘蔗象鼻蟲和人類組織蛋白酶部分純化的中腸半胱氨酸蛋白酶的催化活性。

聚羥基丁酸酯（PHB）是與某些石油化工生產(chǎn)的塑料具有相似特性的細菌性聚酯，這種基于植物生產(chǎn)的生物可再生塑料與基于石油化工生產(chǎn)的塑料具有很高的競爭力。Purnell等［61]發(fā)現(xiàn)積累PHB的幾個轉(zhuǎn)基因甘蔗株系存在統(tǒng)一的時空模式，PHB濃度與PHB生物合成酶具有正相關(guān)性。PHB濃度最大值是葉片干重的1.77%，對農(nóng)藝性狀沒有影響。Tilbrook等［62]通過三酶羅爾斯通氏菌PHA生物合成途徑獲得了轉(zhuǎn)基因甘蔗。PHB積累在甘蔗葉片中，遍及過氧化物酶體和液泡的大多數(shù)葉細胞類型，其含量達干重的1.6%-1.8%，且對植株生長中沒有明顯的毒害效應(yīng)。Petrasovits等［63]為提高PHB產(chǎn)量水平，使用了不同植物和病毒啟動子，以及結(jié)合多基因或單基因載體轉(zhuǎn)化甘蔗。其中，玉米葉綠素A/B結(jié)合蛋白啟動子使生產(chǎn)的PHB高達葉片干重的4.8%，使PHB產(chǎn)量顯著提高。

2.6 其他性狀的轉(zhuǎn)基因甘蔗研究

降低以木質(zhì)纖維素作為底物水解成為發(fā)酵蔗糖的水解纖維素酶的生產(chǎn)成本，是將乙醇制成具有成本競爭力的燃料的主要策略。甘蔗渣是熱帶和亞熱帶地區(qū)最有潛力的可轉(zhuǎn)換成乙醇的木質(zhì)纖維素原料，蔗莖中的水解纖維素產(chǎn)量對使用甘蔗渣生產(chǎn)木質(zhì)纖維素乙醇的經(jīng)濟具有重要的影響。因此，Harrison等［64]使用玉米PepC啟動子而不是玉米ubi1啟動子來控制轉(zhuǎn)基因的表達，將3種纖維素水解酶（CBH I、CBH II和EG）積累于甘蔗葉片，這是重組子CBH I、CBH II和EG在甘蔗中表達和積累的首次報道，也是為經(jīng)濟生產(chǎn)木質(zhì)纖維素乙醇，將纖維素水解酶在甘蔗中的表達邁出重要的第一步。

Zhang等［65]將海藻糖合酶基因，轉(zhuǎn)入甘蔗栽培品種ROC10中，獲得了海藻糖合酶基因正常表達的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株能夠合成和積累海藻糖并提高植株的抗旱性，在自然干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量比對照提高13.6%-24.2%，含糖量比對照提高1.4%以上的轉(zhuǎn)基因株系。這些轉(zhuǎn)基因株系已通過了安全性評估中間試驗，目前正在進行環(huán)境釋放試驗。武媛麗［66]通過抗逆性試驗鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)果聚糖轉(zhuǎn)移酶1-SST基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗具有較強的抗旱性和抗鹽性。

3 展望

近年來，甘蔗轉(zhuǎn)基因育種已經(jīng)取得了令人鼓舞的成果，從原來以抗蟲性、抗病性和提高糖分為主的基因改良延伸到蔗糖純度改良，以甘蔗為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白和生物塑料，為培育第二代能源甘蔗進行的基因改良等。改良的性狀不斷增多，效果不斷提高。但由于轉(zhuǎn)化甘蔗本身比較困難，從甘蔗自身克隆基因和啟動子也比較困難，因此轉(zhuǎn)基因甘蔗還存在使用的啟動子單一，且多為組成型啟動子；目的基因單一；轉(zhuǎn)化效率不高及安全性等問題。因此，今后的工作重點可以從以下幾個方面進行考慮：首先，甘蔗基因組高度復(fù)雜，通過修飾基因的G+C含量等方法提高轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因表達量及其穩(wěn)定性一直是甘蔗轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵；其次，甘蔗有性繁殖困難，若在前期進行多基因轉(zhuǎn)化，獲得多種改良性狀，將會明顯提高育種效率；再次，分離鑒定甘蔗組織特異性啟動子和適用于甘蔗高效表達的啟動子。特別要注意的是全世界對轉(zhuǎn)基因安全性問題的密切關(guān)注，提高安全性是進行轉(zhuǎn)基因甘蔗研究需要考慮的重要問題，因此要注意選擇安全的篩選標記系統(tǒng)或無篩選標記系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)化。隨著甘蔗基因組學(xué)研究的不斷深入，特別是對栽培甘蔗種全基因組測序（http：//sugarcanegenome.org），將為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)輔助甘蔗優(yōu)良品種培育提供豐富的資源信息。

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