造血微環(huán)境的細胞和分子機理

劉佳佳 張亦婷 彭航 劉鵬霞

1978年，Schofield首次提出了干細胞壁龕（niche）的概念［1］。壁龕是一個生態(tài)學術語，有機體的壁龕是指有機體生存的地方、有機體所從事的行為，以及有機體與環(huán)境相互作用的方式的總稱。干細胞的增殖分化行為一方面由自身的遺傳特征決定；另一方面受其所處的微環(huán)境（壁龕）的影響。所謂造血微環(huán)境是指造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）存在于其中的一群組織細胞和細胞外基質，它們分泌多種信號分子，控制著HSC的自我更新和祖細胞的產生［2］。已經證實，造血微環(huán)境失調會引起多種疾病的發(fā)生，包括再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征和原發(fā)性骨髓纖維化等［3-5］。另外，有報道顯示，異體HSC移植后會引起供體細胞白血病，顯示造血微環(huán)境在血液腫瘤發(fā)生中有重要作用［6］。因此，闡明造血微環(huán)境的細胞組成和分子機制對于了解白血病發(fā)病機理和更好地將HSC用于臨床治療有重要意義。

1 造血微環(huán)境的細胞組成

骨髓是HSC在成體中定居的主要部位，也是造血微環(huán)境所在的部位。在骨髓中，HSC進行自我更新和分化，一方面保持一定數(shù)目的HSC存在；另一方面則不斷補充人體循環(huán)血液中的血細胞。已有數(shù)據(jù)顯示，骨髓造血微環(huán)境可以分成兩部分：骨內膜微環(huán)境（鄰近成骨細胞）和血管微環(huán)境（鄰近血竇）。目前已知參與構成造血微環(huán)境的細胞有：成骨細胞、內皮細胞、CAR細胞、nestin+細胞、破骨細胞、巨噬細胞和施萬細胞。

1.1 成骨細胞

成骨細胞是構成骨內膜微環(huán)境的主要組成細胞［7］。早期的研究顯示純化的成骨細胞能支持粒細胞生成以及HSC的存活和增殖［8，9］。之后，研究者證實成骨細胞參與HSC的功能調節(jié)［9-11］。Zhang 等［10］的研究指出，排列在骨表面的N-鈣黏素陽性CD45陰性的梭形成骨細胞（spindle-shaped N-cadherin+CD45-osteoblastic cells，SNO細胞）是造血微環(huán)境的組成細胞，SNO細胞數(shù)目的增加與HSC數(shù)目的增加直接相關。Calvi 等［11］的研究中應用甲狀旁腺激素相關肽（parathyroid hormone related peptide，PTHrP）增加了成骨細胞的數(shù)目，繼而使造血增加。此外，體內試驗中發(fā)現(xiàn)表達皰疹病毒胸腺嘧啶基因的成骨細胞缺陷的轉基因鼠中，造血抑制嚴重［12］。以上研究說明一部分成骨細胞亞群是造血微環(huán)境的組成細胞。但是，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)純化的CD150+CD48-CD41-Lin-HSC不表達N-鈣黏素，而N-鈣黏素被認為是HSC與成骨細胞相互作用的信號分子［13，14］。這些數(shù)據(jù)顯示，SNO細胞可能是通過調節(jié)其他微環(huán)境成分的功能間接影響HSC。

1.2 內皮細胞

內皮細胞是血管微環(huán)境的主要組成細胞。研究發(fā)現(xiàn)HSC動員時，靜止的HSC會離開骨內膜造血微環(huán)境，向骨髓中央遷移，到達血管區(qū)，在那里重建造血［15-17］。因此，研究者提出骨髓中存在第二個特化的造血微環(huán)境，即血管微環(huán)境。

骨髓切片的組織化學檢測顯示，骨髓血竇的有孔內皮處存在具有長期增殖能力的CD150+HSC［18］。單獨輸注內皮祖細胞能夠促進全身輻照小鼠的HSC重建、增強其造血功能，顯示微血管的修復與造血重建相關［19，20］。此外，有人發(fā)現(xiàn)特異性敲除血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的成年小鼠，在接受致死劑量輻照后不能重建造血［21］。而選擇性的激活成年小鼠內皮細胞中的Akt1，會增加HSC數(shù)目、加速輻照后的造血重建［22］。說明內皮細胞是造血微環(huán)境的組成細胞。但是，迄今為止的研究并不能排除內皮細胞通過調節(jié)造血微環(huán)境中其他的組成成分來間接地增強HSC的增殖能力的可能。

1.3 CAR細胞

骨髓血竇內皮細胞周圍包圍著高表達CXCL12的網狀細胞，即富含CXCL12的網狀細胞（CXCL12 abundant reticular cell，CAR細胞），研究者發(fā)現(xiàn)這群細胞也參與了血管微環(huán)境的組成［23-28］。CAR細胞高表達血管細胞黏附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），CD44，CD51和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）受體，是一群性質相對均一的細胞；HSC、淋巴系祖細胞和紅系祖細胞增殖需要CAR細胞，CAR細胞敲除小鼠的HSC數(shù)目減少［26，27］。這些證據(jù)都說明CAR細胞是造血微環(huán)境的組成細胞。

1.4 nestin+細胞

Méndez-Ferrer等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓中nestin+細胞分布于血管周圍，在體內許多HSC和腎上腺素能神經元緊鄰nestin+細胞生長；nestin+細胞敲除的小鼠中，HSC數(shù)目顯著減少；將HSC移植給致死劑量輻照的小鼠后，可見HSC歸巢到了nestin+細胞處，而將HSC移植給nestin+細胞敲除并接受致死劑量輻照的小鼠后發(fā)現(xiàn)，HSC骨髓歸巢減少；顯示nestin+細胞是血管微環(huán)境的組成細胞。這一研究還發(fā)現(xiàn)nestin+細胞中包含間充質干細胞和CAR細胞，說明間充質干細胞也是構成血管微環(huán)境的組成細胞。侯瑞琴等［30］將間充質干細胞聯(lián)合HSC移植到患者體內發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合間充質干細胞移植能明顯改善單倍體相合異基因HSC移植患者骨髓微環(huán)境的損傷狀態(tài)。這一研究進一步證實了間充質干細胞是造血微環(huán)境的組成細胞。

1.5 破骨細胞

Kollet等［31］的報道指出破骨細胞可以通過降解骨內膜的成分，從而促進HSC的動員。Adams等［32］則發(fā)現(xiàn)破骨細胞釋放大量羥基磷灰石鈣，這些羥基磷灰石鈣與HSC上表達的鈣離子受體相互作用，調控HSC功能。用二磷酸鹽處理小鼠破壞其破骨細胞功能后，與對照組相比，試驗組小鼠造血功能恢復較緩慢，說明破骨細胞影響了HSC的功能［33］。以上證據(jù)顯示破骨細胞是造血微環(huán)境的組成細胞。

1.6 巨噬細胞

研究表明，骨組織中的巨噬細胞對骨內膜處的成骨細胞的功能具有調節(jié)作用［34］。在研究粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）對HSC動員作用的試驗中發(fā)現(xiàn)，給予G-CSF減少了支持成骨細胞功能的骨內膜巨噬細胞的數(shù)量，導致骨內膜成骨細胞減少，抑制了骨內膜骨形成，并降低了與HSC滯留在骨內膜微環(huán)境中相關因子及HSC自我更新相關因子的表達［35］。后續(xù)試驗發(fā)現(xiàn)，骨髓單核吞噬細胞的減少促進了造血干/祖細胞動員，主要是由于單核吞噬細胞的減少會導致骨髓中CXCL12水平降低，以及那些與HSC滯留在骨內膜Nestin+微環(huán)境中相關的基因選擇性下調［36］。以上研究表明，巨噬細胞對于維持骨內膜HSC微環(huán)境起著重要的作用。

1.7 施萬細胞

Yamazaki等［37］的試驗表明，神經膠質細胞中的一種細胞——無髓鞘施萬細胞也是造血微環(huán)境的組成細胞，在骨髓中施萬細胞與HSC相鄰，施萬細胞能夠產生轉化生長因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）， 通 過 與 HSC 表 面 的 TGF-β 受體作用，調控HSC滯留在骨內膜微環(huán)境和HSC的自我更新。這一研究小組之前的研究工作已經發(fā)現(xiàn)，細胞因子誘導的脂筏聚集促進HSC進入細胞周期，而TGF-β能夠抑制細胞因子介導的脂筏聚集，進而使HSC處于靜止狀態(tài)［38，39］。以上試驗證實，神經膠質細胞通過分泌TGF-β調控HSC在骨髓微環(huán)境中保持休眠狀態(tài)。

2 造血微環(huán)境和HSC之間相互作用的信號通路

在體內，大部分HSC保持靜止狀態(tài)［40］。不同機體條件下，HSC的自我更新、增殖和分化的相對平衡由微環(huán)境進行調控。目前已知，HSC和造血微環(huán)境組成細胞之間存在以下信號通路。

2.1 CXCL12/CXCR4信號通路

造血微環(huán)境中的基質細胞能夠分泌趨化因子CXCL12，即基質細胞衍生因子1（stromal derived factor 1，SDF-1），CXCL12能夠與HSC表面的CXCR4結合。應用CXCR4拮抗劑后，外周血中HSC數(shù)目增加，顯示CXCL12/CXCR4信號通路參與調控HSC處于靜止狀態(tài)［41，42］。此外，應用CXCL12抗體和CXCR4抗體能夠顯著降低HSC的歸巢［43］。顯示這一信號通路與HSC的靜止狀態(tài)的維持和歸巢相關。

2.2 Notch信號通路

研究顯示，造血微環(huán)境中的成骨細胞表達配體Jagged，當配體結合HSC表面的Notch受體后Notch信號通路激活，Notch發(fā)生蛋白裂解，導致Notch的細胞內結構域轉運到核內，在核內Notch直接作為轉錄激活物起作用，促進HSC的自我更新［9，44］。體外和體內試驗均顯示，在重組活化基因1（recombination activation gene-1，RAG-1）缺陷的Lin－SCA1＋祖細胞中過表達Notch1，會導致HSC和造血祖細胞數(shù)目增多［45］。但是在失去功能的研究中發(fā)現(xiàn)，敲除鼠Notch-1、Notch-2和Jagged-1并不影響HSC和微環(huán)境的功能［46，47］。這提示可能有其他信號通路發(fā)揮同樣的作用。

2.3 Wnt信號通路

已知Wnt信號通路至少有兩個路徑：經典的Wnt/β-連環(huán)蛋白通路和非經典的Wnt/鈣離子通路［48］。經典的 Wnt信號通路促進 HSC 自我更新［49］。非經典的Wnt信號通路也能夠促進HSC自我更新，但是這一作用是通過抑制經典的Wnt信號通路而完成的，具體機制還不清楚［50］。此外，研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路對于HSC靜止狀態(tài)也有影響，Heather等［51］通過體內試驗發(fā)現(xiàn)，抑制HSC的Wnt信號通路會導致HSC中p21Cip1表達下降以及移植后造血再生能力下降，這顯示Wnt信號通路也與限制HSC增殖以及維持HSC的造血重建功能相關。另外，有研究顯示Wnt信號通路與Notch信號通路之間存在整合，協(xié)同調控著 HSC 的功能［52，53］。

2.4 Tie2/Ang-1信號通路

骨髓中處于細胞周期靜止期并具有抗凋亡活性的HSC表達酪氨酸激酶受體2（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains-2，Tie2），與成骨細胞表面表達的Tie2的配體血管生成素1 （angiopoietin-1，Ang-1）結合后，能夠使HSC緊密黏附于微環(huán)境基質細胞，進而保持靜止狀態(tài)［54］。同源篩查發(fā)現(xiàn)Tie2的另一個配體Ang-2是Ang-1的拮抗物，Ang-2會逆轉Tie2/Ang-1信號通路調控HSC功能的作用［55］。具體機制還有待進一步的研究。

2.5 BMP/TGF-β信號通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic protein，BMP） 是 TGF-β家 族 成 員 之 一。BMP-4調 控 著HSC的數(shù)目和功能［56］。體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度BMP-2、BMP-4和BMP-7能夠維持HSC處于未分化狀態(tài)，而低濃度BMP-2、BMP-4和BMP-7促進HSC增殖和分化［57］。體內試驗發(fā)現(xiàn)，特異性敲除小鼠的BMP受體ⅠA后，排列在骨表面的成骨細胞數(shù)目增加，從而導致微環(huán)境中HSC數(shù)目增加［10］。顯示BMP信號通路通過調節(jié)造血微環(huán)境中成骨細胞的數(shù)目而調控HSC。

2.6 Hedgehog信號通路

Trowbridge等［58］研究發(fā)現(xiàn)，激活 hedgehog信號通路會導致大量HSC進入細胞周期，持續(xù)激活hedgehog信號會導致HSC耗竭，顯示hedgehog信號通路調控HSC處于靜止狀態(tài)。但是，也有研究者發(fā)現(xiàn)hedgehog信號通路對于HSC功能的維持不是必須的［59，60］。具體的機理還需進一步的研究來證實。

3 結語

自從提出造血微環(huán)境的概念以來，對造血微環(huán)境的研究已經取得了許多成就。然而，組成造血微環(huán)境的細胞種類比較多，細胞間信號通路比較復雜，還有許多問題有待進一步研究。例如：目前還不清楚組成造血微環(huán)境的細胞的種類究竟有多少；不同細胞之間是否有相互作用。已經知道有些細胞，如巨噬細胞是通過作用于成骨細胞來影響HSC功能的，對于這類細胞的研究還比較少。此外，HSC和微環(huán)境之間存在多種信號通路，這些信號通路之間是如何整合調控HSC的也不清楚。闡明這些問題是在體外培養(yǎng)、擴增HSC，進而將HSC用于再生醫(yī)學的基礎。

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