地衣芽胞桿菌生物活性物質(zhì)應(yīng)用研究進展

楊 陽， 張付云， 蒼桂璐， 王 斌， 盧 航

大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023

地衣芽胞桿菌生物活性物質(zhì)應(yīng)用研究進展

楊 陽， 張付云*， 蒼桂璐， 王 斌， 盧 航

大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023

地衣芽胞桿菌是一種常見革蘭氏陽性菌，具有耐熱、酶系豐富、產(chǎn)酶量高和安全等優(yōu)良特性，同時在代謝過程中還可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，例如多糖、脂肽類生物表面活性劑、桿菌肽及小分子等活性物質(zhì)。本文對地衣芽胞桿菌的活性物質(zhì)及其生物活性的應(yīng)用研究進展進行概括，并且對其通過基因工程手段開發(fā)新型菌種的發(fā)展方向進行了展望，以期為地衣芽胞桿菌的利用提供參考。

地衣芽胞桿菌；生物活性物質(zhì)；應(yīng)用

地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）屬厚壁菌門（Firmicutes）芽胞桿菌科（Bacillaceae），是一種常見的革蘭氏陽性（G＋）細菌，廣泛分布在土壤、空氣和腐敗有機物上。細胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，長2.5～3.5μm；寬0.8～1.5μm。產(chǎn)生近中生的橢圓狀芽胞，包囊稍膨大。細胞染色均勻，很少成鏈。無莢膜，無鞭毛，能運動。最佳生長環(huán)境為35±1℃、pH 7.0左右。地衣芽胞桿菌具有耐熱、酶系豐富、產(chǎn)酶量高和安全等諸多優(yōu)良特性，被認為是較理想的工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要用來生產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶［1～2］。

近年國內(nèi)外對地衣芽胞桿菌的研究報道逐漸增多。研究表明，地衣芽胞桿菌能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，包括多糖、蛋白質(zhì)、非肽類物質(zhì)，和一些小分子活性物質(zhì)［3～4］。本文綜述了地衣芽胞桿菌活性物質(zhì)的種類、生物活性及應(yīng)用情況。

1 多糖類物質(zhì)

根據(jù)多糖的來源，可將其分為動物多糖、植物多糖和微生物多糖三類。多糖具有抗氧化、增強免疫應(yīng)答能力、抑制有害菌、促進有益菌生長等作用，可增強機體抗腫瘤、抗衰老的能力［5］。此外，多糖還具有抗病毒的作用［6］?，F(xiàn)在多糖已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各種領(lǐng)域，并取得了較好的成效。比如Hayen等［7］報道，在日糧中添加酵母多糖，可顯著促進豬、雞和牛等的日增質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率，并且可顯著降低動物的病死率。

地衣芽胞桿菌TS-01是一種益生菌，在發(fā)酵過程中的主要代謝產(chǎn)物之一為多糖。彭愛銘等［5］證明地衣芽胞桿菌TS-01生產(chǎn)的胞外多糖可清除胞內(nèi)DPPH自由基，且多糖濃度越高作用越強，此外還對T淋巴細胞和B淋巴細胞轉(zhuǎn)化有增強作用。由于地衣芽胞桿菌TS-01繁殖速度快，胞外多糖易與菌體分離，其應(yīng)用前景非常樂觀。

2 酶類活性物質(zhì)

地衣芽胞桿菌可產(chǎn)生豐富的胞外酶系，可以有效地降解各種大分子物質(zhì)。

2.1 堿性蛋白酶

堿性蛋白酶是一類非常重要的工業(yè)用酶，它存在于動物、植物及微生物體中，被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、制革、銀回收、醫(yī)藥、食品加工、飼料、化工業(yè)和廢物處理等行業(yè)［8］。

方海紅等［9］對多株Bacillus licheniformis subsp.dangshanensis進行物理化學(xué)誘變，獲得了一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的變異株C-03，該菌株產(chǎn)酶活力高達12 425 U／mL。Pathak等［10］對嗜堿性地衣芽胞桿菌KBDL4的堿性蛋白酶進行了分離鑒定等研究，該菌株的堿性蛋白酶產(chǎn)量很高，具有巨大的發(fā)展前景，不僅為新型堿性蛋白酶基因的克隆和表達提供了新的資源，而且通過誘變育種，還可以進一步提高酶產(chǎn)量，提升該酶耐熱、耐酸及其他性能，以滿足工業(yè)生產(chǎn)大規(guī)模的需求及新領(lǐng)域的開發(fā)。

2.2 彈性蛋白酶

彈性蛋白酶最早由Balo和Banga從胰臟中分離出來［11］，彈性蛋白酶不但能降解彈性硬蛋白，而且對明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白和白蛋白等多種蛋白質(zhì)都有降解作用，具有調(diào)節(jié)高血脂、預(yù)防酒精肝的活性［12］。彈性蛋白酶還可在農(nóng)副產(chǎn)品加工中起嫩化作用［13］。

從動物的胰臟中提取彈性蛋白酶已經(jīng)遠遠不能滿足市場的大規(guī)模需求，因此通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶逐漸受到重視。Chen等［14］研究顯示，地衣芽胞桿菌突變菌株ZJUEL31410所產(chǎn)生的彈性蛋白酶具有較強的耐酸性能和較好的溶酶活性。由于微生物易擴大培養(yǎng)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，且成本低，設(shè)備利用率高，不受原料來源的限制，在生產(chǎn)過程中可以解決許多實際問題。

2.3 α-淀粉酶

α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。在食品領(lǐng)域中，α-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于烘焙工業(yè)中用于改善面粉發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，還可在飲料工業(yè)中用來增強甜味；在醫(yī)藥領(lǐng)域，α-淀粉酶在臨床中用于全自動生化分析［15］。

α-淀粉酶在工業(yè)生產(chǎn)中已成為非常重要的酶制劑之一，地衣芽胞桿菌是產(chǎn)生α-淀粉酶的優(yōu)良菌株。Liu等［16］采用易錯聚合酶鏈反應(yīng)（error prone PCR），通過體外分子定向進化的方法優(yōu)化改進了地衣芽胞桿菌產(chǎn)生的α-淀粉酶（BLA）的酸穩(wěn)定性，使其更適于應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)過程中，而且通過微生物的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)還可以克服傳統(tǒng)提取對原料來源的依賴性。對于優(yōu)良的地衣芽胞桿菌菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶的新功能及新特性還有待進一步探索，以進一步提高其工業(yè)應(yīng)用價值。

2.4 β-甘露聚糖酶

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含有β-1，4-D-甘露糖鍵的甘露多糖的水解內(nèi)切酶，水解獲得的甘露寡糖具有很好的生物調(diào)節(jié)功能，如：促進腸道益生菌的生長、減輕便秘、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、提高飼料利用率以及提高動物生產(chǎn)性能等［17］。目前已在動物、飼料、食品、醫(yī)藥、石油開采以及生物技術(shù)等多方面得到廣泛應(yīng)用［18］。但是天然來源的β-甘露聚糖酶很難滿足工業(yè)生產(chǎn)對酶活、反應(yīng)溫度及pH等多方面的要求，因此開發(fā)活性高、耐溫性能好、成本低的β-甘露聚糖酶勢在必行。Kanjanavas等［19］對地衣芽胞桿菌THCM3.1的內(nèi)-1，4-β-甘露聚糖酶進行了過表達，使該酶具有耐堿、耐有機溶劑和耐熱的特性，具有良好的應(yīng)用前景。

2.5 木聚糖酶

木聚糖酶的主要作用是水解木聚糖，可以應(yīng)用于食品、造紙工業(yè)、廢物利用以及制備乙醇和正丁醇等許多方面。如在食品工業(yè)中可用于果汁、啤酒的澄清，提取咖啡、植物油和淀粉等；在飼料工業(yè)中可以改善農(nóng)作物青貯飼料及谷類飼料的營養(yǎng)成分［20］。van Dyk等［21］對地衣芽胞桿菌SVD1的木聚糖酶多酶復(fù)合體研究發(fā)現(xiàn)，該多酶復(fù)合體的主要活性是木聚糖酶活性，該酶具有較高的最適反應(yīng)溫度（55℃）和較寬的pH范圍等優(yōu)點，應(yīng)用前景良好。

3 脂肽類生物表面活性劑

脂肽類生物表面活性劑具有抗病毒的作用，尤其對皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的滅活效率更高［22］，在醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛。脂肽類生物表面活性劑還具降解有害農(nóng)藥的作用［23］。研究表明地衣菌素是比枯草菌表面活性劑更有效的陽離子螯合劑［24］，在土壤金屬污染治理及原油增采和輸送方面也具有開發(fā)應(yīng)用前景。

4 桿菌肽

桿菌肽又叫枯草菌肽，具有高效抗菌、不產(chǎn)生交叉耐藥性及抗藥性等優(yōu)點，在動物養(yǎng)殖業(yè)中常作為抗生素飼料添加劑［25］。由地衣芽胞桿菌產(chǎn)生的桿菌肽類物質(zhì)，是一種短肽類新型廣譜抗生素，對許多G＋和G-細菌如肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎雙球菌及螺旋體都有較強的抑菌效果［26］，因此，對其進行開發(fā)可為醫(yī)藥、生物飼料等領(lǐng)域提供更多選擇。

5 小分子活性物質(zhì)

地衣芽胞桿菌除了產(chǎn)生多糖和酶等大分子之外，還可形成許多小分子次生代謝產(chǎn)物。

5.1 細胞分裂素

地衣芽胞桿菌能產(chǎn)生細胞分裂素。如劉偉［27］利用地衣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細胞分裂素，并在黃瓜上進行了田間應(yīng)用試驗，結(jié)果表明該物質(zhì)對黃瓜的產(chǎn)量和抗病性均有促進作用，為細胞分裂素的應(yīng)用及地衣芽胞桿菌的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

5.2 苯乙酸

地衣芽胞桿菌可以產(chǎn)生苯乙酸一類的抗菌物質(zhì)，具有抑制多種植物病原菌的功能。Kim等［28］從發(fā)酵的大豆中分離到一株拮抗地衣芽胞桿菌B65-1，通過分離純化得到該菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)，經(jīng)EI-MS和NMR分析確定為苯乙酸，研究發(fā)現(xiàn)其對酵母和多種細菌有拮抗作用。

5.3 生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)

研究表明，地衣芽胞桿菌可產(chǎn)生玉米素、異戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷，這些活性物質(zhì)可作為生長調(diào)節(jié)劑促進作物生長。神州漢邦生物技術(shù)有限公司2004年公布了一項關(guān)于地衣芽胞桿菌生產(chǎn)玉米素、異戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷的植物生長調(diào)節(jié)劑專利［29］，進一步開發(fā)可應(yīng)用于大田生產(chǎn)中。

5.4 特征風(fēng)味化合物

微生物在生長代謝活動與發(fā)酵過程中，通過物理化學(xué)反應(yīng)的相互作用可產(chǎn)生許多特殊的風(fēng)味物質(zhì)，為釀造奠定了堅實的基礎(chǔ)。地衣芽胞桿菌也可形成風(fēng)味物質(zhì)，張榮等［30］在地衣芽胞桿菌的發(fā)酵液中檢測到乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾，是產(chǎn)醬香細菌發(fā)酵產(chǎn)生的特征性產(chǎn)物。

6 地衣芽胞桿菌菌體活性及應(yīng)用

6.1 益生保健作用

有些地衣芽胞桿菌對葡萄球菌、白色念球菌、酵母和大腸桿菌有抑制作用，特別是對某些腸道病原菌有拮抗作用，而對厭氧的有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌擬桿菌、消化性鏈球菌有促菌或共生作用，因此地衣芽胞桿菌已成功應(yīng)用于醫(yī)藥中，如以活體菌株制成膠囊及口服液（如整腸生膠囊），治療腸道疾?。?1］。

另外，翟少華［32］研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌和地衣芽胞桿菌聯(lián)合的腸生態(tài)制劑與化療藥物同時使用，不僅對H22腹水癌細胞具有殺傷和促進凋亡作用，還可延長荷瘤小鼠生命周期，提高化療的效果，為臨床試驗奠定了基礎(chǔ)。

6.2 在動植物上的抑菌活性作用

有些地衣芽胞桿菌對有害菌有明顯的抑制作用，可增強動、植物及人體的抗病力及免疫應(yīng)答能力。因此，地衣芽胞桿菌被廣泛應(yīng)用于飼料及生物農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。周振峰等［33］在奶牛飼料中添加地衣芽胞桿菌制劑，具有增強奶牛抵抗熱應(yīng)激的能力，可抑制有害菌生長，起到防病、抗病的作用。齊東梅等［34］研究表明，地衣芽胞桿菌對棉花枯萎病、黃萎病的病原菌有拮抗作用。張付云等［35］研究表明，地衣芽胞桿菌DNN6對西瓜枯萎病、棉花枯萎病、玉米早疫病、瓜類枯萎病、蘋果粉紅病、番茄灰霉病、辣椒青枯病的病原菌和禾古鐮刀菌等有很強的抑制活性。因此，地衣芽胞桿菌在植物及采后水果病害防治方面具有較大應(yīng)用潛力。

6.3 固氮作用

顧小平等［36］從毛竹根際分離出固氮菌，初步鏡檢其為芽胞桿菌，進一步鑒定確定其主要為多粘芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌，表明地衣芽胞桿菌可能具有與固氮作用相關(guān)的功能。

7 結(jié)論與展望

地衣芽胞桿菌是芽胞桿菌中極具應(yīng)用潛力的菌種之一。它不但具有繁殖能力快，形成芽胞多，抗逆性強的特點，而且能夠產(chǎn)生豐富的活性酶系和其他活性物質(zhì)，如細胞分裂素、抗生素等；此外，地衣芽胞桿菌還可有效促進有益微生物的生長，抑制某些致病菌，因此近年來國內(nèi)外對地衣芽胞桿菌的報道日益增多，尤其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用較為成熟，已經(jīng)形成了完整的整腸生生產(chǎn)工藝。但是目前，大部分應(yīng)用都集中在地衣芽胞桿菌的抗菌特性方面，對其他活性物質(zhì)的應(yīng)用還有待開發(fā)。相信隨著生物技術(shù)的不斷進步，可通過工程菌的構(gòu)造、基因的誘導(dǎo)與表達，將得到耐高溫、耐酸堿、無危害、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高的新型菌種，并將其應(yīng)用于各個領(lǐng)域，推動工業(yè)化生產(chǎn)，造福于人類。

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Research Advances in the Application of Bioactive Substances Produced by Bacillus licheniform is

YANG Yang，ZHANG Fu-yun*，CANG Gui-lu，WANG Bin，LU Hang
College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Liaoning Dalian 116023，China

Bacillus licheniformis is a common Gram-positive bacterium.It has good features of high heat-resistance，variouse enzyme production，good enzyme productivity，and high safety.It also can producemany kinds of bioactive substances such as polysaccharid，lipopeptide biosurfactant，bacitracin and smallmolecular substances.This paper summarizes the research progress of bioactive substances produced by Bacillus licheniformis and their biological activity and application，prospects its development direction of new strains construction by means of genetic engineering，so as to provide references for the future utilization of Bacillus licheniformis.

Bacillus licheniformis；bioactive substances；application.

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.05

2012-12-29；接受日期：2013-01-08

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（2009A164），大連市科學(xué)技術(shù)基金項目（2010J21DW017）資助。

楊陽，碩士研究生，研究方向為海洋微生物資源綜合利用。E-mail：yangyang1987425＠126.com。*通訊作者：張付云，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事海洋生物資源利用研究。E-mail：zhangfuyun2002＠yahoo.com.cn