李淑娟,唐一通
(1.延安大學(xué)西安創(chuàng)新學(xué)院,西安710100;2.湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)系,襄陽441053)
自從1868年瑞士青年科學(xué)家米歇爾在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)核酸以來,有關(guān)核酸研究的進展日新月異,針對疾病診斷、治療和預(yù)防的核酸藥物也應(yīng)運而生[1]。由于其特異性強、作用效率高、免疫原性低、應(yīng)用范圍廣等特點,正日益顯示出重要作用,具有潛在臨床應(yīng)用前景。目前,已經(jīng)上市或進入臨床試驗的核酸藥物根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥物機理可分為三類,分別是寡聚核苷酸藥物、核酸適配體藥物和核酸疫苗。
寡聚核苷酸藥物包括反義核酸、核酶、脫氧核酶以及RNA干擾劑等。這類藥物可以在細(xì)胞中專一性地降低目標(biāo)基因表達水平,通常分子量較小,能夠較容易透過細(xì)胞膜。
反義核酸是人工合成或天然存在的抑制或封閉基因表達的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達,使之低表達或不表達,這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù),該技術(shù)是一種新的藥物開發(fā)方法,利用反義核酸技術(shù)研制的藥物稱為反義核酸藥物,包括反義RNA和反義 DNA,通常是指反義寡核苷酸(ASODN)。反義核酸藥物與傳統(tǒng)藥物的性質(zhì)和作用對象明顯不同,表現(xiàn)為:新的化學(xué)本質(zhì)—核酸;新的藥物受體——mRNA和雙鏈 DNA;新的受體結(jié)合方式——Watson-Crick和Hoogsteen雜交;新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng)等。此外,與傳統(tǒng)藥物主要是直接作用于致病蛋白本身相比,反義核酸藥物作為直接作用于致病編碼基因的治療藥物,具有合成方便、序列設(shè)計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點,可用于多種疾病的治療,主要用于癌癥和病毒感染。目前,反義核酸藥物已在治療癌癥(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、多發(fā)骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、宮頸癌、胰腺癌等)、抗病毒(如HIV、HBV等)、精神疾病、自身免疫病(如牛皮癬、多發(fā)性硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、眼科疾病(如眼膜損傷修復(fù)、白內(nèi)障、青光眼、增生性視網(wǎng)膜玻璃體病變),心血管疾病(如高血壓、冠心病、心臟移植后并發(fā)癥、心力衰竭)中取得了一定的療效[1-4]。許多研究表明Fas配體(FasL)、轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等過表達與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān),因此以這些蛋白為靶點的藥物已成為腫瘤治療的研究熱點。方麗[5]等設(shè)計合成針對FasL的ASODN,并用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞,實驗研究表明FasL ASODN對Tca8113細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用,能夠促進其凋亡,因此FasL的ASODN有望成為舌鱗癌潛在的基因治療方法。孫兆翎[6]等研究了STAT3的ASODN對人宮頸癌HeLa細(xì)胞定植和侵襲功能的影響,結(jié)果表明STAT3基因的特異ASODN可通過下調(diào)STAT3基因表達抑制細(xì)胞的定植和侵襲,從而為治療宮頸癌提供了實驗依據(jù)。雷水生[7]等探討了ASODN對培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF表達的影響,發(fā)現(xiàn)VEGF的ASODN轉(zhuǎn)染可有效抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA表達,降低VEGF分泌,從而抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長。邱梅園[8]等將靶向血小板源性生長因子受體(PDGFR-α)基因的ASODN轉(zhuǎn)染至人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hRPE),實驗證明ASODN通過抑制PDGFR-α基因表達可顯著抑制hRPE細(xì)胞的增殖,并能誘導(dǎo)其凋亡,因此,PDGFR-α的ASODN有可能成為治療或預(yù)防增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)生的新靶點。吳小桃[9]等通過實驗確定了基于過氧化物酶體增殖活化受體α(PPAR-α)設(shè)計的反義寡核苷酸有較好的抗HBV活性,同時也驗證確定了PPAR-α可能成為抗HBV藥物的新型作用靶點。
福米韋生(Vitravene)是全球第一個通過FDA批準(zhǔn)上市的反義核酸藥物,該藥主治艾滋病患者中十分常見的巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎。Vitravene的上市,預(yù)示著反義核酸技術(shù)在藥物領(lǐng)域已經(jīng)結(jié)出果實,是藥物發(fā)展的一個里程碑,從而促進更多的反義核酸藥物上市,如抗艾滋病病毒新藥enfuvirtide(Fuzeon)、專治重癥肌無力的EN101(Monarsen)、治療晚期膠質(zhì)瘤和胰腺癌的AP12009(Trabedersen)等,還有一些反義核酸藥物如治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的oblimersen sodium(Genasense)、治療家族性高膽固醇血癥的mipomersen sodium(ISIS301012、KYNAMRO)、抗哮喘藥物 EPI-2010等處于注冊前期或臨床試驗中。
核酶是一類具有催化功能的RNA分子,它能通過堿基配對特異性地切割底物,降解mRNA,使其失去生物學(xué)功能,是近年來倍受關(guān)注的基因治療方法。與反義RNA相比,核酶不僅具有封閉mRNA的功能,而且具有切割mRNA的功能。目前對于核酶治療癌癥的研究較多。Zhiguo Rao[10]等通過脂質(zhì)體法將抗HPV16-E6核酶、空載體質(zhì)粒分別導(dǎo)入宮頸癌CaSki細(xì)胞,對照發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染核酶的CaSki細(xì)胞E6基因的表達明顯減少,對化療藥物順鉑敏感性增加了2128倍,細(xì)胞凋亡率明顯增加,結(jié)果證實抗HPV16-E6核酶增加了宮頸癌CaSki細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性,從而為宮頸癌的治療奠定了基礎(chǔ)。Yingying Lu[11]等設(shè)計并合成了針對端粒酶RNA的HDV核酶基因,構(gòu)建了該核酶的真核表達質(zhì)粒并將其導(dǎo)入肝癌7402細(xì)胞、結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和正常人L02肝細(xì)胞中,用于檢測該核酶對人端粒酶RNA的體內(nèi)外切割效力。結(jié)果表明,HDV核酶在體外能有效切割端粒酶 RNA,最大切割效率為70.4%;在細(xì)胞內(nèi)能明顯抑制端粒酶活性,抑制細(xì)胞生長,促進細(xì)胞凋亡,該核酶有望成為有效的端粒酶抑制劑,在抑制腫瘤生長中發(fā)揮作用。
脫氧核酶是利用體外分子進化技術(shù)合成的一種具有催化功能的單鏈DNA片段,具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力。脫氧核酶具有切割RNA、切割DNA、激酶、連接酶等活性,其中以對RNA切割活性的脫氧核酶更引人注意,它不僅能催化RNA特定部位的切割反應(yīng),而且能從mRNA水平對基因進行滅活,從而調(diào)控蛋白的表達。方平[12]等針對突變性 p53(mp53)設(shè)計了脫氧核酶"10-23"DZ(p53DZ7、p53DZ9、p53DZ11及硫代修飾物p53DZ11-s),經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進HT29結(jié)腸癌細(xì)胞株,研究發(fā)現(xiàn)p53DZ11、p53DZ11-s在細(xì)胞外均能有效切割mp53RNA,在HT29細(xì)胞內(nèi)p53DZ11-s也能抑制mp53-mRNA及mp53蛋白的表達,為p53突變類型的腫瘤基因治療提供了一個選擇。沈雁冰[13]根據(jù)HBV-X基因的序列設(shè)計針對起始密碼的脫氧核酶來阻斷HBV-X基因的表達,發(fā)現(xiàn)該脫氧核酶對HBV-X基因在肝癌細(xì)胞中的表達有一定抑制作用,從而降低肝細(xì)胞癌的死亡率,提高慢性HBV感染者的生存質(zhì)量,具有很大的社會效益及經(jīng)濟效益。王煒琴[14]等利用小發(fā)卡狀RNA單獨及聯(lián)合脫氧核酶抑制鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒潛伏膜蛋白1(LMP1)基因的表達,發(fā)現(xiàn)小發(fā)卡狀RNA聯(lián)合脫氧核酶能夠提高抑制EBVLMP1基因表達的效率,該研究將RNA干擾和脫氧核酶技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,為探討聯(lián)合基因治療在鼻咽癌治療中的可行性提供了實驗基礎(chǔ)。
RNA干擾(RNAi)是指雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后誘導(dǎo)靶mRNA發(fā)生特異性的降解,導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象,在細(xì)胞中,雙鏈RNA被核酸酶切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA,即小干擾 RNA(siRNA)。siRNA具有高特異性、高效性、穩(wěn)定性及安全性等特點,目前主要用于腫瘤、病毒性疾病、血液病及神經(jīng)退行性疾病等的治療研究[15-18]。夏武[19]等針對 STAT3基因mRNA設(shè)計了5條短發(fā)卡DNA,構(gòu)建了重組SiRNA-ST3 質(zhì)粒(命名為 SiRNA-ST3-1,2,3,4,N),并將其轉(zhuǎn)染入大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒SiRNA-ST3-2、SiRNA-ST3-3能有效靶向沉默STAT3基因,并抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖,該實驗為大細(xì)胞肺癌的臨床治療及基因治療藥物的開發(fā)提供了試驗和理論依據(jù)。Usman[20]等構(gòu)建了針對HCV NS2-NS5B的 siRNA(NS2si-241,NS3si-229,NS3si-858,NS4Bsi-166,NS5Bsi-241 and NS5Bsi-1064),并將其轉(zhuǎn)染Huh-7人肝癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)這些siRNA都能有效抑制HCV的復(fù)制,其中NS5Bsi-1064對HCV RNA的降低超過了90%,這為治療HCV感染提供了一個更好的選擇。劉曉曼[21]等成功構(gòu)建了靶向HBV S基因的siRNA小環(huán)表達載體pmc-H1-siHBS-U6,其能顯著抑制HBV基因的表達與復(fù)制,該研究不僅對探索HBV的基因治療提供了可行途徑,而且為RNA干擾的應(yīng)用提供了新的運載體系。對于血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤——白血病,近年來的研究表明大部分是相關(guān)基因的研究,因此,RNAi也廣泛應(yīng)用于白血病的相關(guān)基因功能研究上,HOXA9基因與白血病發(fā)生有關(guān),朱立平[22]等人設(shè)計了針對白血病 HOXA9的特異性siRNA,應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染人白血病細(xì)胞株U937,結(jié)果顯示靶向HOXA9的siRNA可有效沉默U937細(xì)胞HOXA9基因表達,明顯抑制細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡,為臨床白血病HOXA9基因靶向治療提供了實驗依據(jù)。目前已知一些家族性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)患者的發(fā)病主要是由編碼超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因發(fā)生顯性突變所引起。Wang H[23]等通過化學(xué)修飾保護siRNA,并將其注射入轉(zhuǎn)基因小鼠G93A,結(jié)果顯示經(jīng)修飾的siRNA不但使突變的SOD1基因得到顯著沉默,而且能夠廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個區(qū)域并持久穩(wěn)定存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中,從而延長了siRNA在小鼠體內(nèi)的代謝,可為以siRNA作為藥物靶向治療ALS以及其他神經(jīng)退行性疾病提供更加有效可靠的途徑。
核酸適配體是利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)SELEX篩選出的寡聚核苷酸序列,其作用原理和抗體類似,通過核酸自身形成的三維空間結(jié)構(gòu)和不同靶標(biāo),如有機小分子、RNA、DNA或蛋白質(zhì)等特異性地識別和結(jié)合。核酸適配體相比抗體具有免疫原性低、靶分子廣、易于體外合成和修飾、價格低廉等優(yōu)點,已在臨床疾病的診斷和治療中顯示了廣闊的應(yīng)用前景。目前,最成功地用于臨床治療的核酸適配體藥物是Pegaptanib sodium注射液,商品名為Macugen。Macugen是一種針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的核酸適配體藥物,能選擇性地抑制VEGF165,而VEGF165水平升高與病理性視神經(jīng)血管形成和血管通透性增加有關(guān)。臨床試驗證明其除了治療年齡相關(guān)的黃斑退化病,對糖尿病性黃斑水腫、增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜靜脈狹窄也有一定的療效[24,25],是美國 FDA 在 2004年通過的第一個核酸適配體藥物,它的上市將核酸適配體藥物的研發(fā)推向一個新的高度。
核酸適配體可以獨立應(yīng)用于疾病治療,也可以和其他藥物一起聯(lián)合使用,在腫瘤、病毒及細(xì)菌等方面也發(fā)揮著重要作用[26-30]。最早進入臨床研究的核酸適配體抗腫瘤藥物是AS1411,其靶蛋白為核仁素,該核酸適配體藥物在體外具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力[31,32]。此外,胡艷[33]利用 SELEX 篩選出了一種全新的MUC1核酸適配體MA3,并將阿霉素嵌入MA3的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建了適配體和阿霉素(Apt-Dox)的復(fù)合體,該Apt-Dox復(fù)合體在體外試驗中能夠選擇性地將阿霉素帶入MUC1陽性腫瘤細(xì)胞,同時降低阿霉素在MUC1陰性腫瘤細(xì)胞中的攝取。由于MUC1蛋白在大多數(shù)腺癌(乳腺癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌等)細(xì)胞表面有較高表達,因此該核酸適配體MA3有可能在多種惡性腫瘤的靶向診療方面具有潛在的應(yīng)用價值。Chen[34]等用連有抗肝癌細(xì)胞核酸適配體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)納米粒實現(xiàn)了對不同腫瘤細(xì)胞的檢測。張書芹[35]等采用SELEX技術(shù)成功篩選到急性髓系白血病(AML)M2型患者CD33+/CD34+細(xì)胞的核酸適配體,這為進一步尋找AML-M2白血病細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)記物以及AML-M2型白血病的分子診斷創(chuàng)造了基礎(chǔ)。張寧[36]等以重組HIV-P24為篩選靶,用SELEX技術(shù)從隨機寡核苷酸庫中成功篩選到特異結(jié)合HIVP24的核酸適配體,為其應(yīng)用于艾滋病診斷和治療提供了實驗基礎(chǔ)。Kikuchi[37]等篩選出針對HCV的IRES區(qū)域Ⅱ的核酸適配體,IRES對于mRNA的轉(zhuǎn)錄很重要,因此該適配體通過影響HCV mRNA的轉(zhuǎn)錄,從而影響HCV的復(fù)制。蔡江麗[38]等獲得結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白64抗體的核酸適配體并進行血清學(xué)檢測方面的研究,從而為結(jié)核病的診斷提供了實驗依據(jù)。
核酸疫苗又稱為基因疫苗、DNA疫苗。它是將外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上,然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi),使外源基因在活體內(nèi)表達,產(chǎn)生抗原激活機體的免疫反應(yīng),誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,從而達到預(yù)防和治療疾病的目的。核酸疫苗具有制備方便、生產(chǎn)周期短、安全性好、可引起體液免疫和細(xì)胞免疫雙重效果等優(yōu)點,被認(rèn)為是繼傳統(tǒng)疫苗、基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。近年來,DNA疫苗在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中取得了可喜的成果,顯示出廣闊的應(yīng)用前景[39,40]。尉秀霞[41]等構(gòu)建了 EBV 潛伏膜抗原1(LMP1)的重組DNA疫苗pcDNA-LMP1,其能夠有效表達LMP1蛋白,并能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出LMP1特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng);與重組腺病毒疫苗聯(lián)合應(yīng)用,可以提高特異性CTL應(yīng)答水平。梁艷[42]等對結(jié)核分枝桿菌(MTB)分泌蛋白Ag85A的DNA疫苗抗結(jié)核作用進行了研究,發(fā)現(xiàn)Ag85A質(zhì)粒DNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。Chou B[43]等構(gòu)建了泛素(ubiquitin)基因與水通道蛋白1(AQP-1)基因融合的DNA疫苗pUB-AQP-1,其在C57BL/6J小鼠中能夠有效表達泛素標(biāo)記的水通道蛋白1,這種泛素標(biāo)記的水通道蛋白1能夠被蛋白酶體降解,從而降低水通道蛋白對腫瘤生長和血管新生的促進作用,發(fā)揮抗腫瘤的作用。Weng Y[44]等構(gòu)建了多發(fā)性骨髓瘤黏蛋白1兩串聯(lián)重復(fù)區(qū)(MUC1-2VNTR)基因的重組DNA疫苗pcDNA3.1-2VNTR,該疫苗能誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤小鼠腫瘤特異性體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答,抑制腫瘤生長,延長小鼠壽命,對多發(fā)性骨髓瘤的疫苗治療有重要意義。
近年來核酸藥物在人類重大疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力,為現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)開辟了一個全新的充滿希望的方向。盡管核酸藥物仍存在在體內(nèi)容易被分解和進入細(xì)胞難兩大瓶頸問題,但相信隨著基礎(chǔ)生命學(xué)研究的進一步深入,當(dāng)前核酸藥物研發(fā)面臨的問題都將在實踐中逐步得到解決,從而為治療諸多頑癥帶來新的希望。
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