1株野生大型食用菌的分子鑒定與同源性分析

雷 瓊，汪 儉，范曉丹，章 俊，馬立安 （長江大學生命科學學院，湖北荊州434025）

世界食用菌資源非常豐富，目前有1500～2000種，其中已經(jīng)確認的有981種［1］，大約還有1／2的尚未鑒定。傳統(tǒng)食用菌的分類及鑒定主要是基于菌絲、孢子和子實體的形態(tài)學特征并結(jié)合其生理生化性狀的描述，但由于真菌形態(tài)特征易受到培養(yǎng)條件和其他因素的影響，許多子實體類型經(jīng)常難以獲得，因而傳統(tǒng)的分類方法已無法滿足一些未知品種的分類及鑒定要求。

真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) （internal transcribed spacer，簡稱ITS），又叫內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是位于真菌核糖體DNA上18s和28s基因之間的區(qū)域片段，其兩側(cè)分別是18sRNA基因和28sRNA基因，其長度一般為650～750bp；White等［2－3］于1990設(shè)計了ITS1、ITS4、ITS53對引物可用于大多數(shù)擔子菌和子囊菌的特異性鑒定引物。張智毓等［4］應(yīng)用ITS序列對草原珍稀食用菌蒙古口蘑與其相似的草原蘑菇種進行了真?zhèn)舞b定，PCR擴增分析結(jié)果有效鑒定出了蒙古口蘑，并分析出來自不同地區(qū)采集的蒙古口蘑親緣關(guān)系比較近。李晶等［1］采用形態(tài)學鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學技術(shù)相結(jié)合將1種野生食用菌鑒定為金山巨菇 （Tricholoma sp．）。

因此，將傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學技術(shù)相結(jié)合，能更客觀、真實地反映物種間的差別，而且核糖體r DNA基因轉(zhuǎn)錄內(nèi)部間隔區(qū) （ITS）序列分析可以應(yīng)用于屬下種間及亞種水平的鑒別，從而可以推斷出菌株的確切種類［5］。

1 材料與方法

1．1 供試樣品

供試樣品采集于2012年8月10日在英國諾里奇東安吉利亞大學校區(qū)草坪橡樹 （Quercus）上 （圖1）。將新鮮的子實體烘干后粉碎成粉末并過篩，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 子實體形態(tài)觀察

取子實體完整部分，觀察并描述其表面性狀、結(jié)構(gòu)、顏色、質(zhì)地及切面，進行形態(tài)學特征初步鑒定。

1．3 DNA提取

稱取適量樣品粉末，放入研缽中加入液氮碾磨充分破碎細胞，將碾磨碎粉轉(zhuǎn)入離心管種中，樣品DNA的提取方法參照改進的CTAB法［6］進行。提取的總DNA經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．4 PCR擴增ITS序列

圖1 生態(tài)照

ITS序列上游引物ITS 5：5’－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3’，下游引物ITS4 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’［7］；擴增反應(yīng)于Bio－Rad PCR儀上進行。PCR反應(yīng)體積為25μl，其體系 為 2．5μl 10× Taq Buffer，2．5μl d NTPs （2mmol／L），0．5μl Taq （2U／μl），0．5μl 上 游 引 物（10μmol／L），0．5μl下游引物 （10μmol／L），16．5μl dd H2O，2μl DNA 模板 （100～300）ng／μl。PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物和Mark上樣量均為5μl，電泳結(jié)果于Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。

1．5 ITS片段純化、測序

根據(jù)PCR電泳的結(jié)果，目的條帶單一特異的PCR產(chǎn)物經(jīng)Axy Prep PCR清潔試劑盒純化；有非特異性雜條帶的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、切膠，收集目的片段，凝膠回收試劑盒回收純化；純化后的PCR產(chǎn)物送生工生物 （上海）股份有限公司測序。

1．6 ITS序列比對和同源性分析

將測序獲得的序列通過NCBI進行Blast，分析同源性。當物種的r DNA ITS區(qū)序列與比對的序列同源性達≥99%，可認為相同種；同源性在95%～99%為相同屬；同源性≤95%為相同科［5］。進一步分析相同種或?qū)俚姆植挤秶⑺拗骷氨容^內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（internal space1 ITS1）；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal space 2）；18S r DNA基因序列，5．8S編碼序列，28S r DNA基因序列等信息。

2 結(jié)果與分析

2．1 樣品子實體形態(tài)特征

樣品子實體大型肥厚，肉質(zhì)多汁，復瓦狀疊生，基部愈合呈狹細的柄狀，側(cè)生，從基部分出若干個大小不相等的扇形或半圓形菌蓋，左右數(shù)個相連，常十幾層重疊在一起 （圖2）。幼時顏色鮮艷，表面橙黃至桔紅色，有細絨和皺紋，像雞冠；菌肉白色或淺黃色；后期色漸退，干燥后呈干酪狀、硬而脆等形態(tài)特征。

圖2 子實體形態(tài)

2．2 ITS序列擴增

采用CTAB法提取樣品子實體基因組DNA，ITS5和ITS4引物進行體外PCR擴增，ITS序列PCR產(chǎn)物凝膠電泳如圖3。PCR產(chǎn)物條帶清晰單一，片段大小大于600bp以上，與理論值相符。將產(chǎn)物采用PCR試劑盒純化后送生工生物 （上海）股份有限公司測序。

2．3 ITS PCR產(chǎn)物測序分析

樣品經(jīng)上海生物生工股份公司測序，結(jié)果如圖4。ITS序列長度為609bp，5．8S片段為159bp（圖4方框部分）；G＋C含量為50．9%。

2．4 ITS序列比對

圖3 樣品ITS序列PCR擴增電泳

圖4 樣品測序ITS堿基序列

將樣品ITS序列在NCBI上進行比對 （Blast）分析，結(jié)果如圖5。樣品與硫磺菌 （Laetiporus sulphureus，登陸號EU840609．1）的DNA序列同源性為100%。結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定結(jié)果，鑒定該樣品屬擔子菌亞綱非褶菌目或多孔菌目、多孔菌科、硫磺菌屬，暫命名為硫磺菌種－UK菌株。同時將樣品序列提交Genbank，獲得登錄號為KF897014。

2．5 ITS序列同源性分析

對樣品ITS序列同源性進行進一步分析，結(jié)果如表1。與樣品ITS序列同源性為100%的有2個，登錄號分別為EU840609．1和EU840614．1，均來源于瑞典，生長宿主分別是柳樹 （Salix babylonica）和栓皮櫟 （Quercus variabilis）；同源性為99%的有30個 （表1列出部分），分別來自美國、德國、加拿大、瑞典、丹麥、立陶宛、捷克共和國、烏拉圭和波蘭等國家，沒有發(fā)現(xiàn)英國的報道；宿主來自黑柳（Salix Atrocinrea Brot）、白柳 （Salix alba）、櫟樹 （Quercus）、栓皮櫟 （Quercus variabilis）、桉樹（Eucalyptus spp．）、白蠟樹 （Fraxinus）和酸櫻桃 （Prunus cerasus）等多種樹木。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS 1）一般在161bp左右；5．8S編碼序列一般在159bp左右；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）一般在200bp左右；18S和28S基因序列變化幅度較大。ITS序列一般在500～600bp左右?？梢娏蚧蔷锓N的5．8S具有高度保守性，ITS1、ITS2序列中度保守性，與陳劍山等［2］報道結(jié)果相一致。

圖5 樣品與硫磺菌 （登錄號EU840609．1）ITS序列比對

表1 樣品與同源性100%～99%的硫磺菌ITS序列分析

3 討論

傳統(tǒng)的形態(tài)學特征分類法具有易于觀察和比較的優(yōu)勢，因其由多基因同時決定，具有相對的穩(wěn)定性。但傳統(tǒng)形態(tài)學分類方法也存在不足之處，由于外界的環(huán)境條件、表型的可塑性和基因變異等原因，尤其是地域分隔的原因，造成了食用菌種內(nèi)的形態(tài)多樣性較高的現(xiàn)象，對種和親緣種的鑒定存在分歧，因此，引入分子生物學技術(shù)作為它們的重要補充，便能提供更多有效的分類信息?，F(xiàn)代分類學研究的趨勢將以形態(tài)學研究為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學技術(shù)、生物化學、生態(tài)學等方法進行綜合分類研究，使其在解釋系統(tǒng)發(fā)育、生物進化和生物親緣關(guān)系上可以獲取更多信息，其研究結(jié)果更趨于自然。

本研究將傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學技術(shù)相結(jié)合，鑒定該樣品為硫磺菌 （Laetiporus sulphureus），ITS序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)同源性非常高，其中2個同源性為100%，30個為99%，還有同源98%等等；廣泛分布于美國、德國、加拿大、瑞典、丹麥、立陶宛、捷克共和國、烏拉圭和波蘭等10多國；宿主范圍也廣，生長在黑柳、白柳、櫟樹、栓皮櫟楊梅、栓皮櫟、桉樹、白蠟樹和酸櫻桃等多種樹木上。在同源性99%～100%的32個硫磺菌中，沒有發(fā)現(xiàn)來自英國的報道。英國諾里奇地區(qū)氣候溫和，天氣變化頻繁，全年雨水豐富，有著豐富的野生菌類資源。因此，本研究是對食用菌—硫磺菌物種資源的分布和宿主范圍研究的進一步豐富。

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