杜宗緒
(濰坊職業(yè)學(xué)院,山東濰坊261031)
牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富,是大自然賦予人類(lèi)最有益健康的食品之一,但含有抗生素殘留的牛奶及其制品會(huì)嚴(yán)重為害飲用者的身體健康。此外,抗生素殘留會(huì)影響牛奶品質(zhì),造成乳制品行業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失,還可能被排泄造成環(huán)境污染。膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全性檢測(cè)上表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),在測(cè)定牛奶中抗生素殘留上應(yīng)用前景廣闊。
20世紀(jì)80—90年代,在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了新型體外診斷技術(shù)膠體金免疫層析技術(shù)[1]。其原理是以硝酸纖維素膜為載體,利用微孔膜的毛細(xì)管作用,滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移,通過(guò)抗原抗體結(jié)合,并利用膠體金呈現(xiàn)顏色(紅色)反應(yīng),檢測(cè)抗原/抗體[2]。
用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)牛奶中抗生素的殘留,即牛奶中的抗生素在流動(dòng)過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合,抑制了抗體和硝酸纖維素膜檢測(cè)線(T線)上的抗生素-載體蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合,從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。當(dāng)樣本中沒(méi)有抗生素或其濃度低于試紙條檢測(cè)限時(shí),T線顯色;當(dāng)樣本中的抗生素濃度等于或高于檢測(cè)限時(shí),T線不顯色;而無(wú)論樣本中是否含有抗生素,質(zhì)控線(C線)都會(huì)顯色,以示檢測(cè)有效。
牛奶中的抗生素主要有7類(lèi),即:β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、氯霉素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)。膠體金免疫層析技術(shù)目前已成為牛奶中抗生素殘留檢測(cè)廣泛應(yīng)用的方法,大部分牛奶抗生素已經(jīng)建立了GICA測(cè)定法。
β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素,常用于奶牛等家畜的個(gè)體臨床治療,會(huì)有部分殘留在牛乳中。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)牛奶中14種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素殘留:青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、苯唑青霉素、雙氯青霉素、萘夫西林、頭孢曲松、頭孢喹肟、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢唑啉。研究表明,青霉素G的檢測(cè)限為2~4μg/L,氨芐青霉素的檢測(cè)限為3~4 μg/L,阿莫西林的檢測(cè)限為3~5 μg/L,苯唑青霉素、鄰氯青霉素和雙氯青霉素的檢測(cè)限為6~30 μg/L,頭孢洛寧的檢測(cè)限為 10 μg/L,頭孢唑啉的檢測(cè)限為 15 μg/L,頭孢氨芐的檢測(cè)限為20 μg/L,萘夫西林和頭孢喹肟的檢測(cè)限為20μg/L,頭孢哌酮的檢測(cè)限為40~50μg/L,頭孢曲松的檢測(cè)限為50 μg/L,頭孢噻呋的檢測(cè)限為 4~100 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為 10~15 min。
王利民[3]用膠體金免疫層析法測(cè)定牛奶中的青霉素,結(jié)果表明,當(dāng)樣品中青霉素質(zhì)量濃度低于4 ng/mL時(shí),在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)1條肉眼可見(jiàn)的紫紅色條帶;當(dāng)樣品中青霉素質(zhì)量濃度高于4ng/mL時(shí),在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)出現(xiàn)淺紫紅色條帶,或不出現(xiàn)淺紫紅色條帶。
蒲明等[4]用β-內(nèi)酰胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)多殘留二聯(lián)試紙條檢測(cè)牛奶中12種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,結(jié)果表明,檢測(cè)限為:青霉素G 2~4 μg/L,阿莫西林4~5 μg/L,氨芐青霉素 3~4 μg/L,苯唑青霉素 6~8μg/L,雙氯青霉素6~8μg/L,鄰氯青霉素6~8μg/L,萘夫西林20 μg/L,頭孢喹肟20 μg/L,頭孢曲松50 μg/L,頭孢哌酮 40~50 μg/L,頭孢噻呋 90~100 μg/L,頭孢洛寧 10 μg/L。
馮才偉等[5]研制出檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺類(lèi)和三聚氰胺膠體金試紙條,結(jié)果表明,牛奶中12種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素檢測(cè)限分別為:青霉素G 2 μg/L,阿莫西林 3 μg/L,氨芐青霉素 3 μg/L,苯唑青霉素6 μg/L,雙氯青霉素 6 μg/L,鄰氯青霉素 6 μg/L,萘夫西林20μg/L,頭孢喹肟20μg/L,頭孢曲松50μg/L,頭孢哌酮40 μg/L,頭孢噻呋90 μg/L,頭孢洛寧10 μg/L;假陽(yáng)性率低于5%,假陰性率為0,檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)15 min。
林杰等[6]用基于膠體金免疫技術(shù)的ROSA法同時(shí)快速檢測(cè)新鮮牛奶中的四環(huán)素類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物殘留,結(jié)果表明,檢測(cè)限為:青霉素G 3 μg/L,阿莫西林4μg/L,氨芐西林3μg/L,苯唑西林30μg/L,鄰氯青霉素 30 μg/L,雙氯青霉素 30 μg/L,頭孢氨芐 20 μg/L,頭孢唑啉 15 μg/L,頭孢噻呋 4 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為10 min。
四環(huán)素類(lèi)抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類(lèi)廣譜抗生素,廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌及立克次氏體、衣原體、支原體等所致的感染。牛奶中四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、土霉素、氯四環(huán)素、金霉素5種四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留均可應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),其中,四環(huán)素的檢測(cè)限為10~200 μg/L,土霉素的檢測(cè)限為30~100 μg/L,強(qiáng)力霉素的檢測(cè)限為40~100 μg/L,氯四環(huán)素的檢測(cè)限為 80~100 μg/L,金霉素的檢測(cè)限30~700 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為5~15 min。
蒲明等[4]用β-內(nèi)酰胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)多殘留二聯(lián)試紙條檢測(cè)牛奶中4種四環(huán)素類(lèi)抗生素,結(jié)果表明,檢測(cè)限四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、土霉素、氯四環(huán)素均為 80~100 μg/L。
張銀志等[7]應(yīng)用金標(biāo)快速檢測(cè)試紙條對(duì)食品中四環(huán)素類(lèi)抗生素檢測(cè)進(jìn)行了研究,以四環(huán)素多克隆抗體-膠體金復(fù)合物作為分析探針,四環(huán)素完全抗原作為競(jìng)爭(zhēng)抗原,構(gòu)建分析體系,結(jié)果表明,試紙條檢測(cè)四環(huán)素的檢測(cè)限為200 μg/L,檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)15 min。
付云潔等[8]用膠體金免疫層析法快速檢測(cè)食品中金霉素殘留,采用戊二醛交聯(lián)法制備金霉素-BSA免疫抗原,按照常規(guī)的免疫程序免疫新西蘭大白兔制備抗金霉素多克隆抗體,采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒大小為15 nm的膠體金,并制備抗體-膠體金復(fù)合物,以組裝檢測(cè)試紙,結(jié)果表明,金霉素的檢測(cè)限為0.7 μg/mL,檢測(cè)時(shí)間僅需5 min。
林杰等[6]用基于膠體金免疫技術(shù)的ROSA法同時(shí)快速檢測(cè)新鮮牛奶中的四環(huán)素類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物殘留,結(jié)果表明,檢測(cè)限為金霉素30 μg/L,土霉素 30 μg/L,四環(huán)素 10 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為 10 min。
汪善良等[9]用膠體金試紙條檢測(cè)牛奶中殘留的四環(huán)素類(lèi)藥物,檢測(cè)限四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、金霉素均為 40 μg/L,土霉素為 80 μg/L。
氨基糖苷類(lèi)抗生素是一類(lèi)含有氨基糖苷鍵的抗生素,抗菌譜廣,對(duì)需氧革蘭陰性桿菌具有強(qiáng)大的抗菌活性,臨床應(yīng)用廣泛。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)牛奶中新霉素殘留,結(jié)果表明,新霉素的檢測(cè)限為10~200 μg/L,檢測(cè)時(shí)間為 3~5 min。
Jin等[10]用抗新霉素單克隆抗體鏈接在膠體金上的免疫層析法檢測(cè)牛奶中的新霉素,結(jié)果表明,檢測(cè)靈敏度為10 ng/mL,檢測(cè)結(jié)果與直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA相一致。
劉淑華等[11]用膠體金免疫層析法檢測(cè)牛奶中新霉素的殘留量,結(jié)果表明,牛奶樣品無(wú)需稀釋?zhuān)芍苯訖z測(cè),牛奶中新霉素的檢測(cè)限為200 μg/L,檢測(cè)時(shí)間只需3~5 min;與磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)等藥物均無(wú)交叉反應(yīng),檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好。
氯霉素是一種廣譜抗生素,具有良好的抗菌藥理特性,被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)家禽、家畜、水生動(dòng)物及蜜蜂中各種傳染病的防治,結(jié)果表明,應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)牛奶中氯霉素殘留,檢測(cè)限為1 μg/L,檢測(cè)時(shí)間為 10~15 min。
王瑋等[12]制備了平均粒徑為20 nm的膠體金,用來(lái)標(biāo)記抗氯霉素多克隆抗體,將氯霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶,羊抗兔二抗作為質(zhì)控帶,依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理,建立通過(guò)免疫膠體金滲濾式試紙條檢測(cè)牛乳中氯霉素殘留的方法,結(jié)果表明,樣品前處理方法簡(jiǎn)便,檢出限為1μg/L,10~15min即可目測(cè)判斷結(jié)果。
王玉金等[13]建立了一種膠體金免疫層析法,可快速、簡(jiǎn)易地檢測(cè)樣品中氯霉素的殘留含量。首先,把抗氯霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物包被在膠體金結(jié)合墊上,同時(shí)將人工合成的氯霉素抗原包被在硝酸-醋酸纖維素薄膜表面上,作為檢測(cè)線(T線),其與待測(cè)樣品中氯霉素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體,并能以顏色直觀顯示檢測(cè)的結(jié)果。用GICA測(cè)定60份牛奶樣品,結(jié)果表明,其中,陽(yáng)性20份,陰性40份,試紙條以1 ng/mL為判斷限值,沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性。
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素多為堿性親脂性化合物,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及支原體抑制活性較高。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)牛奶中泰樂(lè)菌素和替米考星等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留,結(jié)果表明,泰樂(lè)菌素檢測(cè)限為25 μg/L,替米考星的檢測(cè)限為50 μg/L,檢測(cè)時(shí)間為10 min。
羅曉琴等[14]以泰樂(lè)菌素單克隆抗體為基礎(chǔ),經(jīng)人工制備替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物和泰樂(lè)菌素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物,應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理,研制出泰樂(lè)菌素和替米考星膠體金試紙條,同時(shí)檢測(cè)牛奶中的泰樂(lè)菌素和替米考星,結(jié)果表明,牛奶中泰樂(lè)菌素和替米考星的檢測(cè)限分別為25,50 μg/L;假陽(yáng)性率低于5%,假陰性率為0,檢測(cè)時(shí)間為10 min,與其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。
磺胺類(lèi)抗生素能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及一些陰性菌,可治療多種細(xì)菌感染,在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于治療由敏感細(xì)菌感染的各種畜禽疾病。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)牛奶中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯噠嗪、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺苯酰、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺多辛12種磺胺類(lèi)抗生素的殘留,結(jié)果表明,磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)限為1~20 μg/L,磺胺異噁唑的檢測(cè)限為10 μg/L,磺胺氯噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶的檢測(cè)限為30 μg/L,磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺苯酰的檢測(cè)限為50 μg/L,磺胺嘧啶的檢測(cè)限為10~60 μg/L,磺胺甲氧噠嗪和磺胺多辛的檢測(cè)限為70 μg/L,磺胺喹噁啉和磺胺甲噁唑的檢測(cè)限為80 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為10~15 min。
張佳宜等[15]采用檸檬酸三鈉法制備40 nm膠體金,電鏡鑒定后標(biāo)記磺胺二甲嘧啶多克隆抗體,磺胺二甲嘧啶半抗原-OVA和羊抗兔二抗分別包被在硝酸纖維素膜上,金標(biāo)抗體噴涂在玻璃纖維墊上,制成免疫層析快速檢測(cè)試紙條,結(jié)果表明,牛奶中的磺胺二甲基嘧啶殘留檢出限為1 μg/L,可在10 min內(nèi)完成檢測(cè)。
王喜亮等[16]用膠體金標(biāo)記磺胺嘧啶單克隆抗體作為顯色劑,磺胺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑,采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式制成膠體金免疫層析試紙,結(jié)果表明,該免疫層析試紙可以在15 min內(nèi)完成對(duì)牛奶中磺胺嘧啶殘留的半定量檢測(cè),讀條系統(tǒng)判定靈敏度為5 ng/mL,肉眼判定靈敏度為10 ng/mL。
李海龍等[17]用膠體金免疫層析法測(cè)定牛奶中的磺胺類(lèi)藥物,結(jié)果表明,檢測(cè)限為:磺胺嘧啶60μg/L,磺胺二甲基嘧啶20 μg/L,磺胺喹噁啉80 μg/L,磺胺氯噠嗪30 μg/L,磺胺間二甲氧嘧啶50 μg/L,磺胺間甲氧嘧啶 50 μg/L,磺胺甲噁唑 80 μg/L,磺胺苯酰 50 μg/L,磺胺對(duì)甲氧嘧啶 30 μg/L,磺胺異噁唑10μg/L,磺胺甲氧噠嗪70μg/L,磺胺多辛70μg/L,假陽(yáng)性率為2%,假陰性率為0。
氟喹諾酮類(lèi)藥物是第3代喹諾酮類(lèi)藥物,具有高效、廣譜、低毒等特點(diǎn),在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用于預(yù)防與治療動(dòng)物疾病。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)牛奶中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星、依諾沙星、惡喹酸11種氟喹諾酮類(lèi)抗生素殘留,結(jié)果表明,恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測(cè)限為20~50 μg/L,沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氟甲喹和達(dá)氟沙星的檢測(cè)限均為20 μg/L,依諾沙星和惡喹酸的檢測(cè)限為 40 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為5~10 min。
魏東等[18]以沙拉沙星(SALX)多克隆抗體與膠體金結(jié)合為金標(biāo)抗體,將純化好的金標(biāo)抗體噴涂在玻璃纖維墊上,包被抗原SALX-OVA和山羊抗兔二抗分別包被在硝酸纖維素膜上,制成免疫層析快速檢測(cè)試紙條,結(jié)果表明,可同時(shí)檢測(cè)牛奶中的沙拉沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留,試紙條的靈敏度為30 ng/mL,檢測(cè)時(shí)間為5~10 min。
何丹婷等[19]應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立了恩諾沙星和環(huán)丙沙星快速檢測(cè)試紙,結(jié)果表明,對(duì)牛奶樣本的檢測(cè)限為50 μg/L,能夠特異性地檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星。
萬(wàn)宇平等[20]用膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類(lèi)單克隆抗體制備了氟喹諾酮類(lèi)膠體金免疫檢測(cè)試紙條,用于牛奶中11種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的檢測(cè),結(jié)果表明,對(duì)牛奶中恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星的檢測(cè)限為20 μg/L,對(duì)依諾沙星、惡喹酸的檢測(cè)限為40 μg/L。檢測(cè)時(shí)間為5 min。試紙條的檢測(cè)結(jié)果與儀器檢測(cè)結(jié)果一致,重復(fù)性較好,在4℃條件下可以保存12個(gè)月。
牛奶是健康飲食中不可或缺的食物,人類(lèi)可以從中獲取能量、優(yōu)質(zhì)蛋白、礦物質(zhì)及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[21]。近年來(lái),抗菌藥物被越來(lái)越廣泛地用于牛奶生產(chǎn),如廣譜的氟喹諾酮類(lèi),高效、價(jià)廉的青霉素被廣泛用于奶牛疾病和乳房炎的防治[22];四環(huán)素、恩諾沙星等藥物用于治療奶牛多殺性巴氏桿菌病[23],因此,牛奶中抗生素殘留問(wèn)題日益受到國(guó)際社會(huì)的重視[24]。為加強(qiáng)牛奶安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障[25],膠體金免疫層析技術(shù)近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)不僅操作簡(jiǎn)便、快速、特異,而且特別適用于廣大基層檢驗(yàn)人員的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。由于樣品成分復(fù)雜,容易影響抗原抗體反應(yīng)和膠體金顆粒與蛋白質(zhì)的吸附,檢測(cè)結(jié)果常出現(xiàn)假陽(yáng)性[26]。因此,膠體金免疫層析技術(shù)在未來(lái)還需向幾方面發(fā)展。
從膠體金免疫層析技術(shù)在牛奶抗生素檢測(cè)的應(yīng)用結(jié)果可以看出,牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)限為1~700 μg/L,檢測(cè)限范圍較大。因此,膠體金免疫層析技術(shù)在未來(lái)應(yīng)提高檢測(cè)靈敏度。
膠體金免疫層析技術(shù)至今已應(yīng)用于14種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,5種四環(huán)素類(lèi)抗生素,1種氨基糖苷類(lèi)抗生素,1種氯霉素類(lèi)抗生素,2種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,12種磺胺類(lèi)抗生素,11種氟喹諾酮類(lèi)藥物的檢測(cè)。牛奶中使用的抗生素種類(lèi)繁多,因此,膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)擴(kuò)大抗生素殘留檢測(cè)范圍。
目前,膠體金免疫層析技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)鮮奶中的四環(huán)素類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物殘留[8]、牛奶中泰樂(lè)菌素和替米考星[14]和牛奶中的沙拉沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留[18]。牛奶中使用的抗生素種類(lèi)繁多,不僅增加了藥物殘留的幾率,也加大了檢測(cè)的難度。因此,應(yīng)開(kāi)發(fā)出同時(shí)檢測(cè)多種藥物的試紙條,大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間及成本。
現(xiàn)在,膠體金免疫層析技術(shù)都是通過(guò)顏色判斷結(jié)果,很容易導(dǎo)致高的假陽(yáng)性和假陰性幾率,結(jié)果也無(wú)法準(zhǔn)確定量。用免疫層析試紙可以在15 min內(nèi)完成對(duì)牛奶中磺胺嘧啶殘留的半定量檢測(cè)[16]。因此,應(yīng)研究膠體金免疫層析技術(shù),實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
綜上所述,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,膠體金免疫層析技術(shù)不僅發(fā)展?jié)摿薮?,而且市?chǎng)和應(yīng)用前景廣闊。在未來(lái)的牛奶抗生素殘留檢測(cè)中,膠體金免疫層析技術(shù)將會(huì)成為重要的技術(shù)手段,并將引起世界各國(guó)的廣泛重視。
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