再生天然絲蛋白的分子構象轉化特征與機理的研究現(xiàn)狀

張野妹，潘志娟，2

(1.蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇蘇州215021;2.現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇蘇州215123)

天然絲包括蠶絲、蜘蛛絲等，由于其優(yōu)異的力學性能再加上良好的生物相容性和生物可降解性而受到了廣泛的關注，尤其是在生物醫(yī)用領域，包括組織工程支架、藥物釋放等方面具有很好的應用前景。但是通過天然絲再生得到的絲蛋白材料的性能，特別是力學性能，卻與天然絲存在較大差距，并因此制約了再生絲蛋白材料的應用。

材料的性能取決于結構，對材料結構的深入探究對提高其性能具有至關重要的作用。二級結構(分子構象)是決定再生天然絲蛋白材料性能的主要因素之一，除了蛋白質(zhì)本身的結構，如氨基酸片段的排列，絲蛋白二級結構還受許多因素的影響，如成絲過程［1］、pH 值、溫度、金屬離子、溶劑、絲蛋白濃度等。近年來，研究人員采用各種測試技術對再生天然絲蛋白材料制備過程中二級結構的轉變進行了探討。用紅外光譜(FTIR)和拉曼光譜分析不同構象絲蛋白的酰胺譜帶在光譜中的吸收位置;X-射線衍射光譜(XRD)是對β-折疊結晶結構進行測定;圓二色光譜(CD)是利用蛋白質(zhì)作為光學活性物質(zhì)，絲蛋白分子在不同波長光下具有圓二色性，即光通過時對左右旋圓偏振光吸收率的差異，進行構象的定性或定量分析;核磁共振光譜(NMR)是利用丙氨酸殘基中Cβ的化學位移對絲蛋白分子構象變化的靈敏度，以及在10×10-6～30×10-6(10～30 ppm)范圍內(nèi)對其去卷積可以得到絲蛋白二級結構的成分信息［2］。隨著科技的發(fā)展，電子順磁共振光譜(EPR)、熒光光譜等越來越多的測試技術被用來進行絲蛋白分子構象含量的測定和轉變機理的研究。

筆者主要對近年來關于再生天然絲蛋白(主要是桑蠶絲素蛋白，下文中簡稱絲素蛋白)溶液或膜，在不同條件下分子構象的轉變特征及機理進行綜述分析，以更好地了解絲蛋白二級結構與性能之間的關系，從而為制備高性能的再生天然絲蛋白材料提供理論基礎。

1 溶劑對天然絲蛋白分子構象的影響

1.1 醇類溶劑的作用

Jin Nam等［3］研究了醇的類型和濃度對再生絲素蛋白構象轉變的影響。用CD測定了加入甲醇、乙醇、丁醇、辛醇等不同類型的醇溶劑后，再生絲素蛋白溶液的構象變化。結合XRD測定結果發(fā)現(xiàn)，加入甲醇和乙醇后，譜圖上都清晰地出現(xiàn)了β-折疊構象的特征，但辛醇處理則沒有出現(xiàn)β-折疊而是保持了無規(guī)卷曲構象;丁醇作用后，譜圖特征則顯示出β-折疊、無規(guī)線團和α-螺旋的混合構象。FTIR的測定結果反映了甲醇濃度的作用為:體積分數(shù)在5%以下時，絲蛋白溶液主要呈現(xiàn)為無規(guī)卷曲結構，大于15%時出現(xiàn)明顯的β-折疊構象，并且強度隨濃度增加而增強。進一步用XRD測定與分析發(fā)現(xiàn)，當體積分數(shù)大于15%時，構象從無規(guī)向β-折疊轉變，與FTIR的結果一致，并且濃度增加后絲素蛋白的結晶度也增大。

陳新等［4-5］運用時間分辨紅外光譜研究再生絲素蛋白膜和溶液經(jīng)不同濃度醇處理后分子構象的轉變機理。實驗結果表明，對于絲素膜，通過膜的溶脹而使絲蛋白分子鏈獲得可以運動的自由空間進而發(fā)生氫鍵重組是構象轉變的前提，醇分子的大小、濃度(水含量)均對構象轉變有顯著影響。由于甲醇分子體積較小可以擴散到膜中使其溶脹，絲蛋白膜在純甲醇中可以發(fā)生構象轉變，但是在純乙醇和純異丙醇中卻幾乎不能發(fā)生構象轉變;當醇濃度太高時，由于水太少膜得不到充分的膨脹而無法進行構象的轉變;當乙醇和異丙醇溶液中水的體積分數(shù)達到7% ～8%時，由于有足夠的水使膜溶脹，絲蛋白開始發(fā)生構象轉變。絲蛋白構象轉變速率隨醇溶液中水含量的增加而增大，當水的含量足夠多時，絲蛋白構象轉變速率不再受膜溶脹速率控制而是受醇濃度的影響，但是當醇濃度太低時，會導致膜的溶解。溶液中由于蛋白分子鏈能夠更自由更完全地移動，所以構象轉變更顯著，并且膜和溶液中蛋白分子構象的轉變都經(jīng)歷了三個階段:1)成核階段，這一階段只有在醇濃度較低時才能看到，速度較慢且速度取決于醇濃度，同時絲蛋白濃度的降低也會使β-折疊結構的形成減慢;2)β-折疊結構快速形成階段;3)β-折疊結構完善階段，速度較慢。

Zhonghou Zheng等［6］用硫氰酸鋰溶液溶解柞蠶絲絲素，經(jīng)過透析后得到柞蠶絲素蛋白水溶液，用圓二色光譜測得絲蛋白水溶液的分子構象主要為α-螺旋和無規(guī)卷曲結構。將絲蛋白水溶液常溫風干后得到絲蛋白膜，并用乙醇處理，然后分別用XRD、FTIR、拉曼光譜測定了乙醇處理前后的絲蛋白膜的分子結構。研究發(fā)現(xiàn)，絲蛋白膜中的分子主要為α-螺旋和無規(guī)卷曲結構，經(jīng)體積分數(shù)為60% ～80%的乙醇處理后，分子構象從無規(guī)卷曲向β-折疊的轉變，乙醇體積分數(shù)在40%以下時膜發(fā)生溶解，而濃度太高時(體積分數(shù)為99.7%)對絲蛋白分子構象基本沒有影響。

Lin Ma等［7］利用圓二色光譜及通過對蛋白原本的熒光性和外加疏水性熒光探針ANS后環(huán)境熒光性的研究，探討了絲素蛋白在醇(包括甲醇和乙醇)-水混合物中分子構象轉變的機理。實驗結果表明，在醇體積分數(shù)達到30%之前，絲蛋白的分子構象顯示的是無規(guī)卷曲，而醇體積分數(shù)達到30%之后出現(xiàn)的是β-折疊構象，說明絲蛋白分子構象在醇-水混合物中從無規(guī)卷曲轉變?yōu)棣?折疊構象，并且這種轉變與溶劑的微觀結構有很密切的聯(lián)系。醇濃度較低時，由于水還是保持原本的四面體結構所以對肽單元的溶解性幾乎沒有影響，而醇濃度較高時，醇水混合物中四面體式的水結構轉變?yōu)殒湕l狀的水結構，使得肽單元之間為了減少與溶劑分子間接觸時的熱力學阻礙而形成分子內(nèi)氫鍵作用，從而誘導絲蛋白β-折疊構象的形成。

醇類是最常見的能誘導絲蛋白分子構象變化的有機溶劑。絲蛋白的構象轉變本質(zhì)上是一個氫鍵重組過程，醇溶液對構象轉變的誘導作用分為兩部分，第一部分是使得分子鏈運動，第二部分是醇分子進入絲蛋白分子鏈中，與絲蛋白分子間產(chǎn)生疏水相互作用，破壞絲蛋白原有氫鍵，從而使分子鏈重排，引起構象的轉變。絲蛋白溶液中由于分子鏈本身就有足夠的運動空間，醇對其分子構象的誘導作用主要是第二部分，所以構象轉變的程度與速度主要取決于醇的濃度。醇濃度越高，對原有氫鍵的破壞能力越強，構象轉變速率越快。而對于再生絲蛋白膜，使膜溶脹以獲取分子鏈自由運動的空間是構象轉變的前提，所以除了甲醇分子體積較小可以直接進入絲蛋白膜中使其溶脹外，其他體積較大的醇類溶劑必須含有一定量的水使膜充分溶脹后才能完成對構象轉變的誘導作用。最近又有另外一種理論認為，當醇-水混合物中醇濃度較高時，四面體式的水結構轉變?yōu)殒湕l狀的水結構，使得肽單元之間為了減少與溶劑分子間接觸時的熱力學阻礙而形成分子內(nèi)氫鍵作用，從而誘導絲蛋白β-折疊構象的形成［7］。

1.2 酸類等溶劑的作用

Rangam Rajkhowa等［8］采用 FTIR 研究了甲酸、三氟乙酸對再生絲素蛋白膜二級結構的影響。以三氟乙酸為溶劑制得的絲蛋白膜，β-折疊含量比絲素蛋白水溶液直接制得的膜稍高，而使用甲酸時，則比前兩者高很多，絲素蛋白膜幾乎成為水不溶性膜。但是不同溶劑制得的絲蛋白膜經(jīng)乙醇處理后β-折疊含量都超過50%，并且α-螺旋轉變?yōu)棣?折疊的速率比無規(guī)卷曲快。

Sung-Won Ha 等［9］綜合采用 XRD、FTIR、13C NMR研究了絲素蛋白(SF)在甲酸或三氟醋酸(TFA)作用下，溶液和固態(tài)絲素蛋白的分子結構。溶液態(tài)的絲素蛋白13C NMR分析表明，兩種混合絲蛋白溶液中都主要為無規(guī)卷曲結構，甲酸/SF溶液中存在少量的β-折疊結構或類似的有序結構，而TFA/SF溶液中存在少量中間變換結構。紅外光譜的測定結果顯示，從絲蛋白水溶液直接凍干的絲素蛋白和再生絲素蛋白膜都顯示無規(guī)卷曲構象，甲醇處理后轉變?yōu)棣?折疊結構，而再生甲酸/SF膜顯示的是β-折疊結構，再生TFA/SF膜則同時包含無規(guī)卷曲和β-折疊結構。XRD分析數(shù)據(jù)進一步說明，甲酸比TFA更有利于絲蛋白β-折疊結構的形成。研究認為，溶劑的選擇應該是使絲蛋白在溶解過程中保持有序的silk I結構而非促使β-折疊結構的形成，然后在固化過程中形成β-折疊結構，這樣才能使再生絲蛋白纖維具有更加優(yōu)異的力學性能。

莫春麗等［10］采用時間分辨全反射紅外光譜研究了醋酸蒸汽在再生絲素蛋白膜中的擴散過程，及其對再生絲素蛋白膜構象轉變的誘導作用。實驗結果顯示，在醋酸蒸汽的作用下，絲蛋白構象轉變?yōu)榱甩?折疊結構，并證實了構象轉變的根本原因在于醋酸分子充分滲透到絲蛋白聚合體中使絲蛋白原有氫鍵斷裂，并重組形成β-折疊結構，同時絲素蛋白膜中水的存在可以加快醋酸分子的擴散速度進而影響分子構象的轉變。

Yu Suzuki等［11］采用NMR研究了絲素蛋白在六氟異丙醇(HFIP)和六氟丙酮三水合物(HFA)兩種溶劑，以及在水溶液中的二級結構差異。1H-13C異核單量子相干光譜表明，絲蛋白在水溶液中有典型的無規(guī)卷曲結構，而在HFIP和HFA中則為α-螺旋結構。

許箐等［12］用拉曼光譜對LiBr溶解的再生蜘蛛絲蛋白膜的構象進行了分析，結果顯示絲蛋白膜中同時包含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲;紅外光譜顯示，用HFIP溶解的絲蛋白膜以無規(guī)和α-螺旋結構為主。

甲酸、醋酸等對絲蛋白的作用與醇類溶劑類似，它們都會促進絲蛋白的分子構象向β-折疊轉變，而六氟異丙醇、六氟丙酮、三氟乙酸、三氟醋酸等溶劑則會使溶液態(tài)的絲蛋白構象保持在螺旋或者類螺旋的結構，而在絲蛋白固化過程中轉變?yōu)棣?折疊結構，從而有可能制得力學性能更好的再生絲蛋白材料性能。

2 金屬離子和pH值對天然絲蛋白分子構象的影響

2.1 堿金屬離子的作用

Qing-Xia Ruan等［13］利用固態(tài)NMR及在此基礎上推廣的二維NMR-NMR相關分析，研究了鈉離子對絲素蛋白構象的影響。當鈉離子的濃度比家蠶腺體內(nèi)鈉離子的含量高很多時，部分絲蛋白的構象會從螺旋結構轉變?yōu)棣陆Y構。絲素蛋白分子構象的變化經(jīng)歷了螺旋或無規(guī)卷曲到類螺旋結構、類β-折疊結構、β-折疊結構的轉變。鈉離子與絲蛋白的結合點可能為某種能促進β-折疊構象形成的氨基酸序列中的羰基氧原子，由于Na+—O結合力較弱，所以鈉離子對二級結構轉變的影響弱于鈣、銅、鉀離子。該課題組［14］還采用二維相關核磁共振技術研究了鉀離子對螺旋/無規(guī)卷曲、類螺旋、類β-折疊、β-折疊這4種構象變化先后順序的影響。分析結果表明，隨著鉀離子濃度從0～3.7mg/g變化時，誘導了絲蛋白構象從螺旋結構向β-結構的轉變，并且變化順序為:螺旋/無規(guī)卷曲→類螺旋→類β-折疊→β-折疊，而繼續(xù)增加鉀離子濃度后，絲蛋白分子構象又從β-結構回到螺旋結構。

Xin-Gui Li等［15］用圓二色光譜研究了金屬離子(Li+、Na+、K+)對再生絲素蛋白水溶液分子構象轉變的影響，發(fā)現(xiàn)這幾種金屬離子都能使絲蛋白溶液從開始的無規(guī)卷曲轉變?yōu)橐?guī)整的β-折疊結構，并且在Li+、Na+、K+三種離子濃度相同的情況下，它們對β-折疊結構形成的作用效果K+＞Na+＞Li+。

陳新等［16］運用時間分辨紅外光譜研究堿金屬鹽溶液對再生蜘蛛絲蛋白膜的分子構象轉變的影響。發(fā)現(xiàn)鈉離子有助于加快β-折疊的形成，而鉀離子則有助于提高蜘蛛絲蛋白膜中β-折疊結構的含量。動力學分析表明，再生蜘蛛絲蛋白膜的構象轉變由快慢兩相組成，其中較快相對應于鏈段運動引起的構象轉變，而較慢相則對應于整條大分子鏈的運動引起的構象轉變。

堿金屬溶液對絲蛋白分子構象的誘導作用是通過堿金屬離子與某些氨基酸殘基片段中羰基氧原子的結合，改變原有絲蛋白分子內(nèi)或分子間的作用，從而實現(xiàn)構象的轉變。由于堿金屬離子(或水化離子)半徑的差異，使它們對絲蛋白分子構象轉變的誘導作用也有所不同［13］。

2.2 銅離子的作用

二價銅離子對絲蛋白分子構象的影響在諸多金屬離子中較為顯著，因此備受關注。

Xiao-Hong Zong等［17］綜合13C NMR、拉曼光譜及Cu(Ⅱ)離子的EPR研究了pH值和銅離子對絲素蛋白分子構象的影響。拉曼光譜的定性分析和13C NMR的定量分析表明，加入適量的銅離子會誘導絲蛋白分子構象從silkⅠ向silkⅡ轉變，并且這種轉變受pH值影響。隨著 pH值從8.0降到5.2，silkⅡ(包括與silkⅡ相關的中間態(tài)結構)的含量增加了1倍多，說明弱酸性環(huán)境更有利于silkⅡ結構的形成。Cu(Ⅱ)的EPR結果顯示:pH值從6.9減小到5.2時，銅離子與絲素蛋白的絡合方式也發(fā)生了從Cu—3N1O到Cu—2N2O和Cu—1N3O的轉變，所以構象的改變和銅離子與絲素蛋白的絡合方式有密切關系。不同pH值下，當銅離子濃度從0.09增大到1.8 mg(Cu)/g(SF)時，silkⅡ含量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，只是pH值不同時，silkⅡ含量達到最大值時的銅離子濃度不一樣。在pH值為5.2時，silkⅡ含量最高的銅離子濃度對應的Cu—2N2O絡合方式的含量也最多，銅離子濃度繼續(xù)增加時，Cu—2N2O絡合方式的含量也減少。這一結果進一步說明銅離子與絲素蛋白絡合方式及分子構象轉變間存在密切關系，并且Cu—2N2O絡合方式可能與silkⅡ構象的形成有關，而Cu—1N3O絡合方式可能導致了silkⅠ以及與silkⅠ相關的中間態(tài)結構的形成。

宗小紅等［18］利用遠紫外圓二色光譜研究了水溶液中Cu(Ⅱ)離子對絲素蛋白構象的影響，結果表明溶液中加入二價銅離子后，絲蛋白分子構象由原來的無規(guī)卷曲向β-折疊轉變，但當二價銅離子濃度太大時β-折疊構象含量反而減少，并且Cu(Ⅱ)離子對絲素蛋白構象的影響遵循“成核依賴性”機理，這與存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的朊蛋白在Cu(Ⅱ)離子誘導下的病變過程非常相似，從而可以為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供幫助。

鐘一鳴等［19］綜合外加疏水性熒光探針ANS和熒光猝滅等多種熒光分析手段，及遠紫外圓二色實驗進一步研究了Cu(Ⅱ)離子誘導絲素蛋白構象轉變的機理。Cu(Ⅱ)離子可能通過與再生絲素蛋白水溶液中的疏水區(qū)域直接絡合，破壞結合點原有的穩(wěn)定結構，從而誘導絲素蛋白發(fā)生構象轉變以形成穩(wěn)定的β-折疊構象，并且銅離子除了會和絲素蛋白的組氨酸殘基絡合外，還會與色氨酸殘基發(fā)生可逆絡合。

二價銅離子雖然和醇類溶劑類似，是通過破壞絲蛋白原有疏水結構的穩(wěn)定性來誘導分子構象的轉變，但是醇類溶劑的破壞區(qū)域是體系中大量存在的疏水相互作用，而二價銅離子則是與絲蛋白分子中特定的點直接進行絡合。

2.3 鐵及其他離子的作用

Dan Ji等［2］研究了鐵離子和亞鐵離子對絲蛋白折疊過程的誘導作用，采用固態(tài)13C NMR、拉曼光譜及鐵離子的EPR分析鐵離子/亞鐵離子對絲蛋白的折疊過程的影響。NMR和拉曼光譜的結果顯示，鐵離子和亞鐵離子對絲蛋白二級結構的影響是不同的。當鐵離子濃度超過臨界值時，會誘導二級結構從螺旋向β-折疊轉變，而亞鐵離子則不能。從絲蛋白silkⅡ含量隨鐵離子濃度的變化曲線中看出，當濃度達到75.0 μg/g時，silkⅡ含量才顯著的增加，說明較少含量的鐵離子可以使絲蛋白中螺旋結構與β-折疊結構的比例保持基本不變，但含量再增加，由于鐵離子與非結晶空隙部分的某些特殊殘基的相互作用而產(chǎn)生更多的β-折疊結構。一旦折疊模式形成，折疊發(fā)生的速度就會因為絲蛋白中疏水部分間強烈的疏水作用而急劇加快，從而導致β-折疊部分的集聚，折疊過程具有成核依賴性。拉曼光譜中I850/I830值可以反映出酪氨酸相關區(qū)域的微環(huán)境，結合NMR數(shù)據(jù)可以得到二級結構和酪氨酸相關區(qū)域微環(huán)境的相關信息，當絲蛋白處于螺旋構象時，I850/I830值為3.25，說明酪氨酸相關區(qū)域為明顯的疏水環(huán)境，而處于較松散的過渡態(tài)結構，如:類螺旋或類β-折疊時，I850/I830值降為2.3左右，但還是處于疏水范圍，說明酪氨酸相關區(qū)域為中度疏水環(huán)境，當絲蛋白處于β-折疊結構時，I850/I830值又回到3.3，此時酪氨酸相關區(qū)域為明顯的疏水環(huán)境。

Ping Zhou等［20］利用二維拉曼相關光譜及13C固態(tài)NMR研究了鈣離子對絲素蛋白分子構象從silk I到silkⅡ轉變的影響。實驗結果表明，鈣離子濃度在10 mg/g時，silkⅡ(包括與silkⅡ相關的中間態(tài)結構)的含量達到最大值，而繼續(xù)增加鈣離子濃度其含量反而減少，說明鈣離子濃度較高時會抑制silkⅡ構象的形成，這可能是因為鈣離子濃度較高時，會誘導凝膠的形成。pH值與鈣離子濃度的混合作用研究表明，silkⅡ構象最高含量仍出現(xiàn)在鈣離子濃度為10mg/g時，并且該鈣離子濃度下，隨著pH值的增加，silkⅡ構象含量減少。雖然在鈣離子濃度小于10mg/g時，對silkⅡ構象的形成有促進作用，但是即使在silkⅡ構象含量總體最高的條件下，silkⅠ構象含量還是占主導位置，所以需要其他條件，比如拉伸流動、剪切力、其他金屬離子的作用等來完成從silkⅠ到silkⅡ的轉變。

周文等［21］采用拉曼光譜研究Fe(III)和Mn(II)對高濃度再生絲素蛋白水溶液中絲蛋白構象的影響，研究表明Fe(III)能夠誘導絲蛋白的構象由無規(guī)線團和(或)螺旋結構向β-折疊轉變，機理與Cu(Ⅱ)相似，但是Mn(II)對絲蛋白的構象沒有明顯的影響。

鐵離子和鈣離子由于與絲蛋白分子的絡合點不同，對絲蛋白分子構象的影響有很大差異，鐵離子的加入有助于β-折疊構象的形成，而鈣離子雖然可以增加β-折疊結構的含量，但是絲蛋白溶液中還是以silkⅠ為主，說明鈣離子有利于維持絲蛋白在溶液中的穩(wěn)定結構。

2.4 pH值的作用

pH值是通過改變絲蛋白所帶電荷的情況來影響絲蛋白分子間的排列，從而使構象發(fā)生轉變。

Ping Zhou等［20］利用二維拉曼相關光譜及13C固態(tài)NMR研究發(fā)現(xiàn)，在pH值較低時，促進了silkⅡ結構的形成;而pH值較高時，分子構象保持了silk I結構的特征，并且pH值對分子構象的影響是質(zhì)子化作用的結果，pH值減少導致質(zhì)子增多，使氨基酸側鏈所帶負電荷減少，分子鏈間更容易靠近形成氫鍵作用，再加上固化過程中水的排出，使得分子間排列更規(guī)整而發(fā)生重折疊。

Wei Wei［22］等利用一種新型的毛細管干法紡絲裝置模擬了蠶的吐絲過程，并研究了pH值對分子構象的影響，結果發(fā)現(xiàn)降低pH值(接近絲蛋白的等電點)有助于 β-折疊分子的形成。Xin-Gui Li等［15］也證實了這一點。

3 溫度和絲蛋白濃度對天然絲蛋白分子構象的影響

彭顯能等［23］用二維相關紅外光譜研究再生絲素蛋白膜的構象與溫度之間的關系。將樣品從130℃升溫到220℃或在180℃的恒溫過程中，絲素蛋白分子鏈的構象會發(fā)生變化。二維相關光譜證實了構象變化響應順序為:先是無規(guī)線團的“崩潰”及氧化過程的發(fā)生，然后才是β-折疊或α-螺旋結構的增加和完善。

Wei Tao等［24］研究了再生柞蠶絲素蛋白水溶液中的分子構象，并研究了溫度和絲蛋白濃度對溶膠-凝膠轉變過程中構象變化的影響。通過圓二色、13C NMR、拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，絲蛋白水溶液的分子構象主要為α-螺旋和無規(guī)卷曲，并存在少量的β-折疊結構，這與桑蠶絲素蛋白水溶液只有無規(guī)卷曲而沒有α-螺旋構象不同。隨著溫度和溶液濃度的增加，凝膠速度增加，凝膠過程中柞蠶絲素蛋白從無規(guī)卷曲向β-折疊構象轉變。

Jin Nam等［3］研究了再生絲素蛋白在不同凝固溫度下的分子構象轉變情況，XRD和FTIR數(shù)據(jù)表明，較高凝固溫度下絲蛋白中出現(xiàn)了較少的β-折疊結晶結構，總體說來溫度從-60℃升高到-10℃對分子構象幾乎沒有影響。

Xin-Gui Li等［15］用圓二色光譜及紫外-可見吸收光譜研究發(fā)現(xiàn)，改變?nèi)芤簻囟群蜐舛?，再生絲素蛋白溶液的分子構象會從開始的無規(guī)卷曲轉變?yōu)橐?guī)整的β-折疊結構，并且β-折疊構象含量隨著溶液濃度和溫度的升高而增加。

溫度通過提供能量讓分子鏈熱運動、重新排列從而實現(xiàn)分子構象的轉變。絲蛋白濃度較大時可以使分子間距減小，更有利于β-折疊結構的形成。這兩種因素對絲蛋白分子構象的作用較溶劑、金屬離子、pH值都小。

4 剪切力等外力對天然絲蛋白分子構象的影響

Chang Seok Ki等［25］通過 CD、FTIR 及固體13C NMR研究了絲膠(SS)在剪切條件下對絲素(SF)溶液構象的影響。剪切前SS/SF混合溶液或膜都主要呈無規(guī)卷曲構象，但隨著SS含量的增加β-折疊片段的含量有所增加;剪切后得到的沉積物，F(xiàn)TIR顯示典型的β-折疊結晶結構，而NMR顯示，除了β-折疊外，分子中還保留有一定量的無規(guī)卷曲結構;剪切后殘余的SF/SS溶液，CD顯示的主要還是無規(guī)卷曲結構，而FTIR和NMR分析結果則不同:加入SS后分子構象主要為β-折疊，并且當SS質(zhì)量分數(shù)為10%時，β-折疊結構含量最高，這種差異主要是因為CD測試的是溶液，而FTIR和NMR測試的則是溶液固化后得到的膜。

Xin-Gui Li等［26］用圓二色光譜、拉曼光譜、紅外光譜等研究了超聲波或擠出處理對再生絲素蛋白溶液分子構象的影響，發(fā)現(xiàn)相比溫度、蛋白濃度、pH值、金屬離子等，超聲波或擠出處理對分子構象的影響更大，處理后無規(guī)卷曲結構含量會穩(wěn)步減少而β-折疊結構含量則顯著增加，并且擠出處理相比超聲波處理更能得到高含量的β-折疊結構。在偏振顯微鏡下可以觀察到，擠出處理后水溶液會出現(xiàn)液晶態(tài)，說明剪切力作用對絲蛋白分子在水溶液中形成液晶態(tài)規(guī)整的β-折疊構象起到了關鍵的作用。

蠶或蜘蛛吐絲過程就是絲蛋白在外力作用下由無規(guī)卷曲或螺旋結構向β-折疊構象轉變的過程，所以外力作用是影響絲蛋白分子構象的一個重要因素，并且這種外力作用往往比其他因素的影響更大。

5 結語

誘導絲蛋白分子構象轉變的外源因素中，除了剪切力等外力作用外，溶劑和金屬離子是較為重要的兩個因素。本質(zhì)上這兩者都是通過破壞絲蛋白原有疏水結構的穩(wěn)定性來誘導分子構象的轉變，只是兩者的作用區(qū)域不同，溶劑的破壞區(qū)域是體系中大量存在的疏水相互作用，而金屬離子則是與絲蛋白分子中特定的點直接進行絡合。與絲蛋白分子的作用點及其離子(或水化離子)半徑的差異，使不同種類的金屬離子對絲蛋白構象轉變的影響也有所不同，其中銅離子和鉀離子對形成β-折疊結構的作用較為顯著;溶劑中，醇類溶劑可以通過對再生絲蛋白材料進行后處理使其分子構象β-折疊化，而六氟異丙醇等有機溶劑則有利于絲蛋白在溶液狀態(tài)時保持穩(wěn)定的silk I構象。較低的pH值可以促進β-折疊的形成，而溫度與絲蛋白濃度對絲蛋白分子構象的影響較小。

再生天然絲蛋白材料由于其廣闊的應用前景受到了越來越多的關注，對絲蛋白二級結構進行系統(tǒng)的研究，了解溶劑、金屬離子等外源性因素對絲蛋白二級結構的影響，可以為高性能再生天然絲蛋白材料的制備條件提供優(yōu)化的指導性信息。

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