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    解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥機制研究

    2013-04-08 06:01:22姚宇紅指導(dǎo)
    實用中醫(yī)藥雜志 2013年4期
    關(guān)鍵詞:含藥化瘀貴陽

    劉 思,姚宇紅(指導(dǎo))

    (1.貴陽中醫(yī)學(xué)院2010級碩士研究生,貴州 貴陽550002;2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,貴州 貴陽 550003)

    解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥機制研究

    劉 思1,姚宇紅(指導(dǎo))2

    (1.貴陽中醫(yī)學(xué)院2010級碩士研究生,貴州 貴陽550002;2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,貴州 貴陽 550003)

    目的:探討解毒化瘀方對HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥逆轉(zhuǎn)機制。方法:通過制備含解毒化瘀藥的兔血清培養(yǎng)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株后,用免疫組化法檢測細(xì)胞的多藥耐藥基因P-gp。結(jié)果:解毒化瘀方含藥血清能下調(diào)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株的P-gp表達(dá)。結(jié)論:解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥與其能下調(diào)P-gp的表達(dá)有關(guān)。

    解毒化瘀化方;逆轉(zhuǎn);多藥耐藥;P-gp

    目前白血病治療中最棘手的問題是長期化療藥物導(dǎo)致的多藥耐藥現(xiàn)象,我們采用解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機制有一定效果,總結(jié)如下。

    1 材料

    解毒化瘀方水煎劑的制備:將解毒化瘀方(青黛10g、川芎10g、莪術(shù)15g、山慈姑15g、丹參20g、虎杖20g、重樓30g、補骨脂30g)的飲片放于煎煮容器內(nèi),加1~2L冷水浸泡30min,煮沸后文火煎熬,直至藥物濃度為1g/mL,再將藥液過濾出來,棄去藥渣。

    含藥血清的制備:將18只新西蘭大白兔(購于貴陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心)隨機分為3個不同劑量組,各組分別按低劑量組3g生藥/kg體質(zhì)量、中劑量組6g生藥/kg體質(zhì)量、高劑量組12g生藥/kg體質(zhì)量,灌服中藥液,每日1次,連續(xù)3天。于末次給藥后2h無菌條件下心臟取血,分離血清,組內(nèi)血清混合,用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    正常兔血清的制備:灌藥前1天取兔血,分離血清,方法同前。

    試劑及儀器:RPMI-1640培養(yǎng)基(sigma公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),MTT試劑盒(凱基生物),P-gp試劑盒(北京博奧森生物)。超凈工作臺(中國蘇州),CO2培養(yǎng)箱(美國NAPCO),通用酶標(biāo)儀(BIO-TEX美國),倒置顯微鏡(日本尼康TS100-F)。

    2 方 法

    2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

    HL60細(xì)胞的培養(yǎng):HL60細(xì)胞接種于含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞,2~3天傳代1次,更換細(xì)胞液。

    HL60/VCR細(xì)胞的培養(yǎng):HL60/VCR細(xì)胞接種于含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,并加10μg/mL的VCR維持,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞,2~3天傳代1次,更換細(xì)胞液。

    2.2 細(xì)胞的檢測

    MTT檢測細(xì)胞毒作用:取1×105對數(shù)生長期白血病HL60和HL60/VCR細(xì)胞株細(xì)胞,用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,每孔180μL,加至96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)3個平行孔,分3個劑量VCR組,加入不同濃度VCR后,細(xì)胞在培養(yǎng)板中適應(yīng)生長12h,分別加入實驗藥物各20μL,使每孔終體積為200μL;每一板次測定,均設(shè)一列全空白對照組,不加細(xì)胞和藥物,同樣作其它處理,光密度掃描時,以該列光密度值作本底,校正其它測量值。在37℃,5%CO2濃度,飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h,每孔加入5mg/mL的MTT液20μL,相同條件下培養(yǎng)4h,離心去上清,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL,微量振蕩器振蕩10min,充分溶解藥物,于自動酶標(biāo)儀檢測各標(biāo)本吸光度(OD)值,計算耐藥倍數(shù)。

    免疫組化方法檢測P-gp表達(dá):采用免疫酶標(biāo)組化方法,將細(xì)胞懸液1×109/L加入24孔板中,每孔1mL。其中12孔再加入含藥血清,37℃、5%CO2孵育2h,細(xì)胞涂片,依次加入一抗、二抗、三抗,堅固紅顯色及蘇木素復(fù)染,普通顯微鏡觀察,陽性結(jié)果為玖瑰紅色。

    2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    3 結(jié) 果

    MTT細(xì)胞毒作用:在HL60、HL60/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度梯度VCR,培養(yǎng)72h后,VCR對兩種細(xì)胞是產(chǎn)生了不同的抑制作用,根據(jù)自動酶標(biāo)儀檢測HL60細(xì)胞IC50濃度OD值為33.127,HL60/VCR細(xì)胞IC50濃度OD值為149.001,求得HL60/VCR細(xì)胞耐藥倍數(shù)為4.5倍。解毒化瘀藥對HL60/VCR細(xì)胞P-gp表達(dá)水平的影響:經(jīng)免疫組化染色后,可見未加藥HL60/VCR細(xì)胞被染成玫瑰紅色,經(jīng)含藥血清處理后的HL60/VCR細(xì)胞,染色降低,與未加藥的HL60/VCR細(xì)胞比較有顯著差異,中藥血清聯(lián)合干擾素組亦可見染色明顯降低,研究顯示P-gp在HL60/VCR細(xì)胞中成高表達(dá),HL60細(xì)胞成低表達(dá),加用解毒化瘀方含藥血清處理后,高中低劑量組和干擾素組能夠明顯降低P-gp在HL60/VCR細(xì)胞中的表達(dá),而空白對照組和兔血清組對表達(dá)無影響。

    4 討 論

    中醫(yī)對白血病多藥耐藥逆轉(zhuǎn)機制的研究也取得了一定的進展,田亮等[1]研究發(fā)現(xiàn)藤黃酸能通過下調(diào)Survivin及P-gp蛋白的表達(dá),增強耐藥細(xì)胞對治療藥物的敏感性,從而逆轉(zhuǎn)白血病K562/A02細(xì)胞的耐藥作用。解毒化瘀方對白血病細(xì)胞多藥耐藥機制也有一定的逆轉(zhuǎn)作用,中醫(yī)認(rèn)為白血病主要是因為溫?zé)岫拘暗娜肭?,其耐藥主要是由于毒邪留戀,擾亂血絡(luò),導(dǎo)致毒瘀互結(jié),病情頑纏,反復(fù)發(fā)作[2]。解毒化瘀方中青黛清熱解毒、涼血消腫,含有靛玉紅對細(xì)胞內(nèi)的周期依賴性蛋白激酶有抑制作用,致癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3]。山慈姑清熱解毒、消腫散結(jié),含秋水仙堿,能抑制細(xì)胞的有絲分裂,對多種癌細(xì)胞有殺滅作用[4]。重樓清熱解毒、消腫止痛,鄢圣英等[5]研究發(fā)現(xiàn)重樓復(fù)方水煎劑能使癌組織壞死,并且與藥物的濃度呈正相關(guān)性?;⒄?、莪術(shù)、川芎、丹參活血、行血、散血、涼血。補骨脂補腎助陽,其內(nèi)含有補骨脂素為鈣離子通道拮抗劑,蔡宇等[6]研究發(fā)現(xiàn)補骨脂素能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度逆轉(zhuǎn)HL60/HT耐藥細(xì)胞的耐藥。白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進行含解毒化瘀藥的兔血清培養(yǎng)后,再進行涂片染色,其細(xì)胞的著色并不是很好明顯的玫瑰紅色,說明細(xì)胞中P-gp的含量并不高。而沒有加用含藥血清的細(xì)胞組中的細(xì)胞染色比較明顯,呈現(xiàn)很明亮的玫瑰紅色,說明原耐藥細(xì)胞上的P-gp表達(dá)很高。通過兩組的對比發(fā)現(xiàn),解毒化瘀藥含藥血清能夠降低細(xì)胞上的P-gp蛋白,證明解毒化瘀方能夠逆細(xì)胞藥株耐藥的機制是降低細(xì)胞上的P-gp表達(dá)。含解毒化瘀藥血清組又分高中低3個組,在分別進行染色后發(fā)現(xiàn)著色深淺不同,含高劑量藥物的血清組明顯比含中劑量藥物的血清組的著色淺,而含中劑量藥物的血清組又明顯比含低劑量藥物的血清組的著色淺,說明不同的藥物濃度對P-gp的表達(dá)影響不同,其中濃度高的下調(diào)P-gp的能力要比濃度低的強,即藥物下調(diào)細(xì)胞上的P-gp的強度與藥物濃度呈正相關(guān)性,證實解毒化瘀藥逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥的機制與其能夠下調(diào)P-gp有關(guān),并且這種關(guān)系是正相關(guān)性。馬武開等[7]在對白血病HL60/ADR細(xì)胞Mdr1、NF-JB的表達(dá)及解毒化瘀藥的干預(yù)作用的研究中也發(fā)現(xiàn)含解毒化瘀藥濃度越高的血清作用效果越明顯。另外,在藥物的對照組中還有西藥干擾素對照,雖然干擾素對耐藥細(xì)胞也有逆轉(zhuǎn)作用,但用干擾素與含藥血清合用后效果更為明顯,細(xì)胞呈現(xiàn)的顏色更淺,證實了含藥血清對耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用。

    [1]田亮,劉娟,陳寶安,等.藤黃酸對白血病K562/A02細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2012,20(2):252-257.

    [2]馬武開.難治性白血病從毒論[J].中國醫(yī)藥學(xué)報,2004,19(4):241.

    [3]劉雅波,陶文沂.18種青黛7-氮雜靛玉紅對6種腫瘤細(xì)胞增殖的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22(5):899-906.

    [4]厲秀云,李振民.疏肝健胃清熱解毒法治療胃癌前病變65例[J].陜西中醫(yī)雜志,2009,30(1):7-8.

    [5]鄢圣英,余建平,袁珂,等.蚤休復(fù)方水煎劑抗癌作用及對肝腎毒副作用的研究[J].中藥材,2008,31(12):1855-1857.

    [6]蔡宇,余紹蕾,徐炎,等.補骨脂素對HL60/HT耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)及對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響研究[J].中國藥學(xué)雜志,2006,41(12):905-907.

    [7]馬武開,李玉瑩,姚血明,等.白血病HL60/ADR細(xì)胞M drl、NF-κB的表達(dá)及解毒化瘀藥的干預(yù)作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,32(5):592-595.

    Objective:To study the reversion of MDR mechanism of Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula on HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains.Method:HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains were cultured with rabbit serum containing Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula,then the MDR gene P-gp was detected by immunohistochemistry method.Result:The serum containing Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula could down-regulate the expression of P-gp of HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains.Conclusion:The reversion of MDR of Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula on HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains is related to that it could down-regulate the expression of P-gp.

    Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula;reversion;MDR;P-gp

    R255.737

    B

    1004-2814(2013)04-241-02

    2013-01-31

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