禽流感的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

荊玉偉 （山東省諸城外貿(mào)綠安檢測(cè)有限公司 262200）

禽流感是一種急性傳染病，每次爆發(fā)不但給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。由A型流感病毒引起的禽流感，其臨床癥狀因感染禽的種類(lèi)、年齡、病發(fā)感染情況及新感染毒株的毒力不同而表現(xiàn)不一致，其病理變化因感染病毒株毒力的高低、病程長(zhǎng)短及種類(lèi)不同表現(xiàn)也不盡相同，而且無(wú)一為特征性癥狀和剖檢變化。因此，快速、特異的診斷技術(shù)對(duì)于禽流感的預(yù)防顯得非常重要。近年來(lái)，隨著血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，禽流感診斷技術(shù)的研究也不斷深入相繼建立了病毒分離鑒定、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、分子生物學(xué)等診斷技術(shù)。本文就這些方法的基本原理、檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)以及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為控制禽流感的疫情贏得時(shí)間。

1 病毒的分離鑒定

由于禽流感的臨床癥狀和剖檢變化較大且無(wú)特征性病變，所以多年來(lái)禽流感的確診一直依賴(lài)于病毒的分離和鑒定，禽流感病毒分離和鑒定的方法在工作中不斷被完善。一般用無(wú)菌的棉拭子從活禽的氣管和泄殖腔采取深部病料放入無(wú)菌培養(yǎng)液，或無(wú)菌采取病變組織磨碎制成10%懸液，然后接種于9～11日齡SPF雞胚，收獲24～96h的死胚和96h仍存活的雞胚尿囊液，測(cè)其血凝活性，若血凝活性為陰性，應(yīng)將收獲的雞胚尿囊液原倍繼續(xù)盲傳2～3代。對(duì)具血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清作HI試驗(yàn)，以排除新城疫病毒的可能性。對(duì)新城疫病毒血清的HI陰性者再用瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)來(lái)檢測(cè)特A型禽流感病毒的型特異性。最后用禽流感病毒分型血清作血凝抑制試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(NI)以鑒定A型流感病毒的亞型。在病毒分離和鑒定的同時(shí)，一般還需做病毒的致病性試驗(yàn)，以確定所分離的毒株是高致病力株還是低致病力株或是非致病力株。病毒的分離鑒定對(duì)禽流感的診斷可做最終確診，但其操作程序復(fù)雜，花費(fèi)高，耗時(shí)耗力。

2 血清學(xué)檢測(cè)

2.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn) HI試驗(yàn)是進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所采用的普及方法。當(dāng)檢測(cè)出具有血凝素活性的樣品后，需要用已知陽(yáng)性血清進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，并據(jù)此確定其亞型，也可用試驗(yàn)來(lái)測(cè)定和定量感染后或注射疫苗后的特異性血清抗體。試驗(yàn)是通過(guò)特異性抗體與相應(yīng)亞型的作用后，封閉了其血凝素的活性而抑制了現(xiàn)象。此外，還有加酶法，即將抗原和抗體在37℃或室溫下作用下，加入雞紅細(xì)胞，該法檢測(cè)的抗體效價(jià)比常規(guī)方法高2～4倍。試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速、特異性好，是亞型鑒定的常用方法。由于用已知亞型的抗血清不能檢出新的亞型，所以用該法鑒定不如瓊脂擴(kuò)散凝膠試驗(yàn)簡(jiǎn)便快捷。

2.2 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID) 免疫擴(kuò)散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴(kuò)散而形成肉眼可見(jiàn)的帶狀或線(xiàn)狀沉淀帶。AGID是用來(lái)檢測(cè)A型流感病毒群特異性血清抗體即抗核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)的抗體的一項(xiàng)試驗(yàn)，AGID最常用的方法是免疫雙擴(kuò)散(IDD)。另外，還有免疫單輻射擴(kuò)散試驗(yàn)(SRD)和對(duì)流免疫電泳(CIE)。其中SRD可對(duì)抗體進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。而CIE相對(duì)而言則較為敏感，操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間最短，1h即可出結(jié)果。李海燕等(2000)用O.5g/ml的NP-40處理病毒蛋白作為AGID試驗(yàn)用抗原，能檢出禽流感各型陽(yáng)性血清，而與ND、MD、IB等15種其他雞的疫病陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)。鄧國(guó)華等人用禽流感病毒核蛋白作為抗原進(jìn)行AGID試驗(yàn)，并取得了良好效果。趙增連等(1997)在瓊脂板中加入3%的PEG-6000，則AGID的敏感性提高，且更加快速省時(shí)。

2.3 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(NIT) 根據(jù)A型流感病毒的表面抗原特性，特別是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)特性，不僅可通過(guò)HI試驗(yàn)對(duì)病毒進(jìn)行鑒定，而且可通過(guò)NI試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。1983年R.A.Van.Deusen介紹了NI試驗(yàn)的一種改進(jìn)法-平板微量NI試驗(yàn)，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類(lèi)和抗體檢測(cè)的快捷方法。試驗(yàn)證明，微量NI試驗(yàn)?zāi)軐?duì)分離物做出準(zhǔn)確鑒定，而常量M試驗(yàn)檢測(cè)亞型混合物更敏感。目前很多獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)所己將微量NI試驗(yàn)列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規(guī)方法。此法快速，成本較低，重復(fù)性好。這種技術(shù)的可靠性將導(dǎo)致NI試驗(yàn)的廣泛應(yīng)用。

2.4 病毒中和試驗(yàn)(VNT) 用VNT來(lái)鑒定或滴定禽流感病毒時(shí)，可以雞胚或組織培養(yǎng)細(xì)胞，操作方法與其他病毒的VNT相同，一般常用給定病毒稀釋血清法：用100EID50或1000TCID50的病毒與RED處理過(guò)的倍比稀釋的血清等量混合，室溫作用1h，每枚雞胚（9～11日齡）或每瓶細(xì)胞接種0.2ml，每個(gè)稀釋度接種4個(gè)胚或細(xì)胞瓶，37℃培養(yǎng)72h至7d，檢查接種雞胚尿囊液的血凝活性或血細(xì)胞吸附作用的最高稀釋度即為中和抗體滴度。中和試驗(yàn)因其操作繁瑣，耗時(shí)耗料，所以臨床上幾乎不用。但中和試驗(yàn)作為經(jīng)典的方法在病毒鑒定中起很重要的作用，許多新的檢測(cè)方法都要以此標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行比較。

2.5 免疫熒光技術(shù)(IFT) IFT的基原理是用熒光素標(biāo)記的抗體仍能和相應(yīng)的抗原形成免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物由于有熒光素的參與，借助于熒光顯微鏡能觀察到細(xì)胞內(nèi)病毒抗原及其存在的位置，從而檢測(cè)病毒抗原。早在1961年就開(kāi)始用于人類(lèi)流感的快速診斷。IFT的敏感度同病毒分離相當(dāng)，有時(shí)高于用雞胚進(jìn)行的病毒分離，應(yīng)用IFT通過(guò)單克隆抗體可檢測(cè)A型流感病毒(H1N1)血凝素的抗原變異情況。IFT用于診斷，應(yīng)注意避免或降低標(biāo)本中出現(xiàn)的假陽(yáng)性(及非特異性熒光抗體)問(wèn)題。免疫熒光用于禽流感的診斷具有快速(2h之內(nèi))、特異和敏感性高的特點(diǎn)，但是其不能鑒別HA和NA亞型，而且需要特殊的設(shè)備(熒光顯微鏡)，受主觀影響大需工作人員需具有一定的經(jīng)驗(yàn)，所以在基層檢測(cè)單位推廣應(yīng)用具有一定的局限性。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA具有無(wú)可比擬的敏感性，其基本原理是將抗原或抗體吸附到固相載體的表面，并仍能保持其免疫活性?？乖蚩贵w與酶所形成的結(jié)合物各自保持其免疫學(xué)活性和酶的催化活性。結(jié)合物與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，免疫復(fù)合物上的酶在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，可催化底物水解、氧化或還原，從而產(chǎn)生有色物質(zhì)，可用肉眼觀察。由于反應(yīng)顏色的深淺與相應(yīng)抗體或抗原的量成正比，故可對(duì)抗體或抗原進(jìn)行定量測(cè)定我國(guó)建立的禽流感間接ELISA和禽流感抗體斑點(diǎn)診斷技術(shù)，即可用于早期診斷，又可用于抗體的監(jiān)測(cè)。斑點(diǎn)ELISA結(jié)果易于判定，特別適合現(xiàn)場(chǎng)禽流感抗體檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。ELISA具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化、便于大批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)使其得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

3 禽流感分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.1 常規(guī)RT—PCR技術(shù) 該方法的基本原理是：從病料或者雞胚尿囊液中提出禽流感病毒的RNA作為模板，加入所設(shè)計(jì)的引物，反轉(zhuǎn)錄酶及dNTP，在適宜的緩沖液及溫度下合成cDNA。再以cDNA為模板，加入設(shè)計(jì)的上、下游引物，在DNA聚合酶作用下利用dNTP在PCR儀上合成新的DNA鏈，擴(kuò)增過(guò)程以變性、退火、延伸為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)35個(gè)左右的循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量已足夠用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。該方法能直接檢出病毒基因，較病毒分離快。但是，容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性以及出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶、片狀帶或涂抹帶現(xiàn)象。應(yīng)注意控制好環(huán)境污染問(wèn)題，核酸的提取和凝膠電泳要在不同的環(huán)境中操作，要及時(shí)清理PCR產(chǎn)物和電泳后的廢棄物，避免PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染和EB對(duì)環(huán)境的污染。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR 實(shí)時(shí)定量RT-PCR是以常規(guī)PCR、核酸雜交和信號(hào)放大結(jié)合的實(shí)時(shí)、在線(xiàn)檢測(cè)的定量PCR技術(shù)，主要分為利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加的探針類(lèi)，用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加非探針類(lèi)兩種。已應(yīng)用于禽流感檢測(cè)的主要是基于Taqman技術(shù)，其原理是Taqman探針的5'端標(biāo)記一個(gè)熒光分子，3'端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅分子，當(dāng)探針完整時(shí)，兩者可發(fā)生熒光共振能量傳遞(FRET)。當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，由于Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針?biāo)?，使熒光分子與淬滅分子間距增大，從而破壞其FRET，則熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能檢測(cè)到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA，就多一個(gè)熒光分子，隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)。該技術(shù)比常規(guī)PCR更快，更靈敏，特異性更強(qiáng)。用此法測(cè)定未知標(biāo)本中的病原體核酸，不僅能快速定性，還因?yàn)闊晒釶CR本身先進(jìn)的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和強(qiáng)大的信息處理能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體核酸的定量，因此得到較廣泛的應(yīng)用。此法早已在2004年作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，被應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)和大型禽肉出口企業(yè)。

3.3 依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù) 依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)是一項(xiàng)以RNA為模板的快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)使用三種酶(AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶)以及2條特定引物共同協(xié)作完成。在設(shè)計(jì)NASBA引物時(shí)，使一個(gè)引物的5′端帶有T7RNA，另一個(gè)引物的5′端序列含有與釕標(biāo)的電化學(xué)檢測(cè)探針(ECL p robe)互補(bǔ)的序列聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列，通過(guò)光電信號(hào)的檢測(cè)作出靶RNA的定性、定量研究。其特點(diǎn)是整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，大大避免了PCR過(guò)程中復(fù)雜的溫度變化。與RT-PCR比較，在同一時(shí)間內(nèi)NASBA擁有更高的擴(kuò)增效率，并且可減少樣品中抑制性物質(zhì)的影響，降低核酸污染的可能性，檢測(cè)時(shí)間縮短2.5h。這個(gè)分析檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、易于操作，而且在檢測(cè)過(guò)程中與臨床相關(guān)的病毒無(wú)交叉反應(yīng)能力，為確定疫情和采取防范措施爭(zhēng)取了寶貴時(shí)間。

3.4 基因芯片技術(shù) 由于流感病毒擁有眾多的型和亞型，無(wú)論是現(xiàn)存的那一種診斷方法，都無(wú)法同時(shí)對(duì)所有的流感病毒進(jìn)行精確的分型?；蛐酒夹g(shù)可以對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，它的出現(xiàn)為同時(shí)對(duì)流感病毒進(jìn)行檢測(cè)和分型提供了可能的途徑。禽流感基因芯片技術(shù)是一種比較系統(tǒng)、完善的檢測(cè)技術(shù)。原理是將大量的核酸分子探針以大規(guī)模陣列形式排布在很小的載玻片等載體上，通過(guò)與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。該方法的建立不僅有助于禽流感疫情各種亞型的有效監(jiān)控，而且可以在第一時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)新變異或基因重排的新亞型病毒。

4 結(jié)語(yǔ)

禽流感的傳統(tǒng)檢測(cè)診斷技術(shù)隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，以及同其它學(xué)科間的滲透與結(jié)合，禽流感技術(shù)一定會(huì)取得新的進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)診斷的快捷、方便、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)、易操作，為禽流感的防治做出重大貢獻(xiàn)。

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