固相萃取在喹諾酮類獸藥殘留液質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

馬建民 艾君濤 曹 靖 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京 房山 102442)

獸藥痕量殘留分析中，樣品的前處理極為重要，也是其難點(diǎn)所在。由于動(dòng)物組織多樣性和復(fù)雜性，目前還沒有一種前處理技術(shù)能夠適合所有情況下的所有樣品。本文對(duì)近年來發(fā)展起來的固相萃取、碳納米管固相萃取、限進(jìn)介質(zhì)固相萃取、免疫親和固相萃取、分子印跡固相萃取、基質(zhì)固相分散萃取、分散固相萃取等在喹諾酮類獸藥殘留液質(zhì)(LC-MS)檢測(cè)分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，對(duì)未來的發(fā)展前景作了展望。

喹諾酮類(Quinolones，QNs)是人類繼磺胺類藥物之后在抗菌藥物合成方面最重要的突破，因其具有高效，低毒，組織穿透力強(qiáng)及價(jià)格低廉等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中。但隨著該類藥物的大量和非科學(xué)地使用，造成其在動(dòng)物體內(nèi)殘留，并通過食物鏈進(jìn)入人體，從而影響人體健康。因此，動(dòng)物體內(nèi)的QNs殘留檢測(cè)備受關(guān)注。由于動(dòng)物組織基質(zhì)復(fù)雜，提取凈化方法的優(yōu)劣成為測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵。固相萃取(SPE)作為一項(xiàng)前處理技術(shù)，在食品安全檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

1 固相萃取

SPE是一種基于色譜分離的樣品前處理方法。固相萃取包括固相(具有一定官能團(tuán)的固體吸附劑)和液相(樣品及溶劑)。裝有固體吸附劑的固相萃取裝置包括：固相萃取柱、固相萃取膜、固相萃取吸嘴、固相萃取芯片等。由于固體吸附劑具有不同的官能團(tuán)，能將特定的化合物吸附并保留在SPE柱上。

1.1 常見固相萃取材料

常見固相萃取材料主要包括：鍵合硅膠材料、無機(jī)基質(zhì)固相萃取材料、有機(jī)聚合物固相萃取材料及混合型固相萃取材料。

1.1.1 鍵合硅膠吸附劑的基質(zhì)是硅膠 一般在pH2～7的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。不同廠家生產(chǎn)的C18柱，由于顆粒大小不同，孔徑大小不同，含碳量不同，封尾的程度不同等原因，在相同的操作條件下得到的結(jié)果可能會(huì)有很大不同。

1.1.2 無機(jī)基質(zhì)固相萃取材料 主要是無機(jī)氧化物和石墨碳類無機(jī)物。無機(jī)氧化物有活性硅土、氧化鋁、弗羅里硅土等。這些無機(jī)材料的共同特點(diǎn)是表面具有活性羥基，可以用于正相萃取。石墨碳類，即可保留非極性化合物又可保留極性化合物，而且特別適合用于水溶性的極性化合物的萃取。

1.1.3 聚苯乙烯-二乙烯基苯 (PS-DVB)具有疏水表面，屬于有機(jī)聚合物非極性的固相萃取材料。吸附能力比C18更強(qiáng)。含有不同極性官能團(tuán)的化學(xué)改性聚合樹脂材料具有很好親水性，在萃取水中的極性化合物能夠得到較高的回收率。二乙烯基苯-N-吡咯烷酮聚合物(DVB-VP)具有親脂性基團(tuán)二乙烯基苯和親水性基團(tuán)吡咯烷酮，比反相鍵合硅膠吸附劑的應(yīng)用更廣泛。且DVB-VP的親水官能團(tuán)，使得吸附劑得到充分潤(rùn)濕，即便柱床干了也沒有明顯影響。

1.1.4 混合型固相萃取材料 混合型SPE柱具有多種類型的官能團(tuán)，可以和目標(biāo)化合物發(fā)生多種作用力，從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中萃取分離目標(biāo)化合物。例如，Waters公司生產(chǎn)的Oasis MCX和Oasis MAX。趙維國(guó)[1]在《食品中抗生素和農(nóng)藥殘留分析：用于LC-MS分析的SPE樣品前處理方法》中，詳細(xì)介紹了Oasis MCX 和Oasis MAX選擇和使用方法。

1.2 新型固相萃取材料

1.2.1 碳納米管固相萃取 碳納米管(CNTs)是由單層或多層石墨片圍繞中心軸按一定的螺旋角卷繞而成的無縫、中空的“微管”，每層由一個(gè)碳原子通過sp2雜化與周圍3個(gè)碳原子完全鍵合后所構(gòu)成的六邊形組成的圓柱面。根據(jù)形成條件的不同，碳納米管存在多壁碳納米管(MWNTs)和單壁碳納米管(SWNTs)兩種形式。MWNTs一般由幾層到幾十層石墨片同軸卷繞構(gòu)成，層間間距為0.34nm左右，其典型的直徑和長(zhǎng)度分別為2～30nm和0.1～50nm。SWNTs由單層石墨片同軸卷繞構(gòu)成，其側(cè)面由碳原子六邊形排列組成，兩端由碳原子的五邊形封頂。管徑一般10～20nm，長(zhǎng)度一般可達(dá)數(shù)十微米，甚至有長(zhǎng)達(dá)20cm的SWNTs。與MWNTs相比，SWNTs具有直徑分布范圍小，缺陷少，更高的均勻一致性等特點(diǎn)。SWNTs存在3種類型的可能結(jié)構(gòu)，分別為單臂碳納米管、鋸齒形碳納米管和手性碳納米管[2]。

CNTs與化合物之間存在π-π共軛等相互作用力和較強(qiáng)的表面吸附作用，作為固相萃取吸附劑可用于多種殘留物的凈化分析。趙海香[2]使用多壁碳納米管(WMCNTs)固相萃取柱對(duì)雞肉和豬肉中的3種四環(huán)素類和兩種喹諾酮類藥物凈化并進(jìn)行了液質(zhì)檢測(cè)。其中，喹諾酮類的檢出限為5μg/L，減少了基質(zhì)效應(yīng)。

1.2.2 限進(jìn)介質(zhì)固相萃取 限進(jìn)介質(zhì)固相萃取材料(RAM)除了具有用于吸附目標(biāo)化合物的官能團(tuán)外，在固相萃取材料的外表面進(jìn)行親水性修飾，具有阻擋干擾大分子的作用，同時(shí)又使得大分子蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生不可逆的變性，避免了因變性蛋白質(zhì)堵塞SPE填料微孔而造成柱效降低的問題。RAM材料具有以下幾個(gè)特征：具有特定的排阻屏障；具有生物兼容的外表層；具有吸附功能的內(nèi)表層。Varian公司的Bond Elut Plexa系列的聚合樹脂柱是商品化的RAM柱。

包曉麗[4]使用Bond Elut Plexa固相萃取柱檢測(cè)了牛奶中22中QNs類藥物。結(jié)果表明：定量限(LOQ)為0.008～0.339μg/kg。除了氟甲喹、萘啶酸、那氟沙星的回收率小于60%外，其它喹諾酮的回收率均在63.1%～94.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86%～13.12%。

1.2.3 免疫親和固相萃取 免疫親和固相萃取(IASPE)是將免疫親和技術(shù)與固相萃取技術(shù)交叉地結(jié)合在一起，用于樣品的分離凈化?；诜肿幼R(shí)別機(jī)理的IASPE，以高親和性及高選擇性的抗原-抗體作用使得人們可以一步萃取及濃縮特定的目標(biāo)化合物。

趙思俊[5]用喹諾酮單克隆抗體制備的IASPE，建立可同時(shí)測(cè)定動(dòng)物肝臟組織中10種NQs的方法。IASPE的凈化方法為：用15ml磷酸鹽緩沖液（PBS）平衡；取肝臟樣品提取上清液上樣；PBS、水洗滌IASPE；甲醇-PBS(7:3)洗脫、收集、氮?dú)獯蹈伞BS定容、待檢；IASPE加15～20ml PBS溶液再生，4℃冰箱保存。

1.2.4 分子印跡固相萃取 分子印跡固相萃取(MISPE)是以分子印跡聚合物(MIP)為吸附劑的固相萃取。分子印跡固相萃取吸附劑是一種穩(wěn)定性很高的聚合物。MIP是通過兩個(gè)以上的不同種類的單體聚合而成的共聚物。首先是將經(jīng)過細(xì)心選擇的官能團(tuán)單體與模板組合在一起，然后，在交聯(lián)劑存在下，這些單體與聚合材料進(jìn)行聚合反應(yīng)。最后，將模板除去，得到具有選擇性官能團(tuán)的三維立體結(jié)構(gòu)的MISPE吸附劑。最直接的模板分子就是選用待測(cè)目標(biāo)化合物。MIPSPE柱能夠選擇性地從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中萃取相關(guān)的目標(biāo)化合物。

朱桂芬[6]制備了加替沙星分子印跡聚合物(MIP)微球，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了深入研究。夏環(huán)[7]以諾氟沙星為模板分子，合成了對(duì)氟喹諾酮類特異性識(shí)別的MIP，其印跡因子為3.17，親和位點(diǎn)總數(shù)為3.37μmol/g.。該MISPE可吸附溶解在乙腈中的諾氟沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星，而被不同比例水乙腈洗脫。劉芃巖[8]以左氧氟沙星和環(huán)丙沙星為模板分子，合成了復(fù)合模板分子印跡聚合物，制成了MISPE柱，用于草魚中10種NQs的萃取，富集凈化。與單模板分子印跡聚合物只選擇吸附單一物質(zhì)相比，可同時(shí)吸附和解吸一類物質(zhì)，更適合于多殘留藥物的同時(shí)分離富集。

2 基質(zhì)固相分散萃取

基質(zhì)固相分散(MSPD)是將樣品與固體吸附劑一起研磨之后，使樣品成為微小的碎片分散在固相吸附劑表面。然后將此混合物裝入空的SPE柱或注射針筒中，用適當(dāng)?shù)娜軇⒛繕?biāo)化合物洗脫下來。

MSPD萃取技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)有：適用于固體、半固體及粘稠樣品的萃??；萃取溶劑與目標(biāo)化合物的接觸面積增大，有利于目標(biāo)化合物的萃?。蝗莘e完全滲入樣品基質(zhì)中，提高了萃取效率。但是該技術(shù)不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，手工操作工作量大。

3 分散固相萃取

分散固相萃取(d-SPE)是將固相萃取吸附劑顆粒分散在樣品的提取液中，除去樣品中的雜質(zhì)干擾物。d-SPE最典型的應(yīng)用是在多農(nóng)藥殘留檢測(cè)中使用的QuEChERS樣品前處理方法?；赿-SPE的基本原理，博納-艾杰爾科技公司提出了MAS(multi-adsorption reverse SPE)樣品萃取凈化方法。將粉碎的樣品置于離心管中，加入提取溶劑，試劑(如無水硫酸鈉、無水硫酸鎂等除水劑)及填料，均質(zhì)或超聲波萃取，離心后取上清液進(jìn)行儀器分析。MAS方法具有快速、萃取和凈化一步完成的特點(diǎn)，但是難以實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量物質(zhì)的富集，凈化效果有時(shí)不理想，對(duì)某些雜質(zhì)無法除去。

曹軍[9]用分散固相萃取同時(shí)檢測(cè)了19種喹諾酮類藥物。前處理方法：樣品加入無水乙酸鈉，無水硫酸鎂；1%冰乙酸(用正己烷飽和)乙睛溶液提??；旋蒸；氮吹干；甲醇-水(2:8)定容，然后加適量PSA吸附劑、C18吸附劑，上清液過濾膜，進(jìn)行測(cè)定。不同基質(zhì)應(yīng)調(diào)整吸附劑的用量，避免其對(duì)藥物產(chǎn)生吸附。李鋒格[10]用分散固相萃取建立了雞肝中12種磺胺類、19種喹諾酮類和8種苯并咪唑類藥物及其代謝物殘留的分析方法。文章中指出，存在基質(zhì)干擾，需要使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和同位素內(nèi)標(biāo)定量。

4 小結(jié)

隨著LC-MS的普及，開發(fā)LC-MS方法成為趨勢(shì)。但是檢測(cè)生物樣品時(shí)，LC-MS常出現(xiàn)基質(zhì)干擾現(xiàn)象[11]。解決基質(zhì)干擾的方法之一就是改進(jìn)樣品的前處理。相對(duì)傳統(tǒng)前處理方法，固相萃取技術(shù)顯然是目前最可能滿足這一要求的方法。

固相萃取技術(shù)處理樣品，有兩種模式，一種是吸附目標(biāo)化合物，一種是吸附雜質(zhì)。從吸附目標(biāo)化合物方面考慮，應(yīng)提高吸附劑與目標(biāo)化合物作用力，如MIP固相萃取材料。這種選擇性強(qiáng)的吸附劑，不利于建立多殘留的檢測(cè)方法。從吸附雜質(zhì)角度考慮，明確各種組織的主要干擾物，使用凈化不同雜質(zhì)的吸附材料包，并確保其對(duì)目標(biāo)化合物的不吸附。兩種方法可以結(jié)合使用。

可見，使用固相萃取技術(shù)，降低基質(zhì)干擾，需使用選擇性強(qiáng)的吸附劑；要增加檢測(cè)的數(shù)量和種類，需使用選擇性差的吸附劑，或者使用吸附雜質(zhì)的吸附劑。可以展望在未來的一段時(shí)間里內(nèi)，將現(xiàn)有的SPE技術(shù)更廣泛的應(yīng)用于食品檢測(cè)，將是科研工作者的主要工作。

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