魚類低溫應激研究進展

■章雪丹 葉超霞 冼健安 王安利

（華南師范大學生命科學學院，廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室，生態(tài)與環(huán)境科學廣東普通高校重點實驗室，廣東廣州 510631）

魚類應激是指魚類受到各種有害作用的刺激（自然環(huán)境、生物因子、人為干擾以及魚類個體間相互作用的變化）后引起的一系列非特異性防御反應(孫儒泳等,2008)。水溫是影響魚類代謝過程的最重要外界因素之一，涉及到整個生命周期（孫德文等，2003）。低溫作為應激原之一，導致魚類生理和行為發(fā)生改變，引起其全身非特異性變化，如低溫使機體的糖皮質激素分泌過多，從而嚴重抑制機體免疫功能，誘發(fā)疾病發(fā)生等（程軍等，2004）。近年來，我國南方水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)因寒潮造成重大的危害和巨大的經(jīng)濟損失，僅以經(jīng)濟損失超億元的情況為例，水產(chǎn)門戶網(wǎng)（2008）報道，2008年廣東漁業(yè)經(jīng)濟損失超過50億元，福建漁業(yè)直接經(jīng)濟損失達1.6億元；中國食品科技網(wǎng)（2009）報道，2009年廣東省漁業(yè)經(jīng)濟損失2.67億元；廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局（2011）報道，2011年廣西漁業(yè)經(jīng)濟損失超過一億元。凍災已給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了如此巨大的經(jīng)濟損失，目前低溫應激對魚類的影響已成為學者們重點關注的問題之一。本文就魚類低溫應激的研究進展進行綜述，以期為后續(xù)更深入的研究提供參考。

1 低溫應激下魚類的生理響應

1.1 低溫應激下魚類營養(yǎng)物質代謝響應

1.1.1 氨基酸代謝

低溫會影響蛋白質的穩(wěn)定性和折疊速率，所以在低溫應激下機體為了保持蛋白功能，會通過改變其離子對數(shù)目和蛋白分子間的疏水作用來調整蛋白質的靈活性(Jaenicke R，1990；Fujita J,1999)。Todgham等(2007)認為，北極魚(Trematomus bernacchii,T.pennellii,Pagothenia borchgrevinki)泛素結合蛋白的水平比新西蘭等地的魚高，是因為在極端低溫應激下，魚體的蛋白質平衡被打亂，使更多的蛋白質變性。冀德偉等（2009）報道，當水溫從20℃急性降溫至8.5℃時，岱衢族大黃魚(Pseudosciaena crocea)血清總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）濃度顯著降低，但隨著時間的延長，其濃度又升高。常玉梅等（2006）認為，雄性荷包紅鯉抗寒品系(Cyprinus carpiovar.wuyuanensis)(♂)與雌性大頭鯉(Cyprinus pellegriniPellegrini)(♀)的雜交后代F2在急性降溫初期TP含量下降（水溫從15℃降至6℃），但隨著水溫繼續(xù)下降（4℃）含量有所回升；隨著低溫作用時間的延長（溫度從16℃降至4℃后再冷馴化3 d），其TP和ALB含量顯著升高，這些可能都是因溫度超出魚類耐受范圍，產(chǎn)生應激蛋白。由此可見，在低溫應激下，蛋白質分解的氨基酸，可能部分氨基酸會用于抗應激相關蛋白質合成和周轉。

蛋白質分解的部分氨基酸本身可能就承擔著抗應激功能（周萌等，2011）。酪氨酸是兒茶酚胺的前體物質，低溫應激下動物消耗大量酪氨酸，增加髓質兒茶酚胺類的分泌，從而動員機體脂肪、肝糖原和肌糖原，促進分解代謝（程軍等，2004）。分解代謝能為魚體提供能量，有利于抵御寒冷。Chen等（2002）認為，低溫應激通過影響（水溫從25℃急性降至12℃）吉富羅非魚(Oreochromis aureus)的酪氨酸代謝而影響血液中兒茶酚胺的分泌量，使由其轉化的激素（下丘腦去甲腎上腺素、頭腎的腎上腺素和去甲腎上腺素）含量顯著下降，從而導致白細胞的噬菌作用受抑制和抗體水平降低。蛋氨酸是機體內最重要的甲基供體，能參與腎上腺素、肌酸、膽堿、肉堿的合成和核酸的甲基化過程，其含量不足會導致魚體抵御低溫的能力下降（程漢良等，2005）。有關降溫對魚類蛋白質及其代謝的影響機理還有待進一步研究。

1.1.2 脂肪酸代謝

Lyons的“膜脂相變”學說認為，低溫首先是使細胞膜的膜相從液晶相變?yōu)槟z相，低溫應激下生物膜保持適當流動性跟生物耐寒性之間有一定的相關性，而生物膜的流動性主要取決于膜脂的脂肪酸組成，膜脂的不飽和脂肪酸含量和魚類抗寒性也有一定的相關性，對低溫下代謝相關基因表達的研究已在分子水平上證明了這一點，因此控制脂肪酸去飽和反應提高不飽和脂肪酸含量可以改善魚類的抗寒性（Hsieh S L等，2003）。

低溫應激下魚體內組織細胞膜的脂肪酸組成會發(fā)生適應性變化。當體溫在低溫應激下降低時，對此很敏感的魚類脂肪酸代謝，會通過積累磷脂中長鏈不飽和脂肪酸的含量，使膜仍保持穩(wěn)定性和流動性，從而抵御寒冷(常玉梅等，2006；Farkas T，1980)。低溫應激會導致魚類脂肪酸組成改變，其中最明顯的是不飽和脂肪酸比例快速上升。Hazel等(1979)報道，虹鱒(Oncorhynchus mykiss)在低溫適應期間肝臟膜磷脂中高不飽和脂肪酸n-3(n-3PUFA)含量相對增加，而飽和脂肪酸含量減少，單不飽和脂肪酸維持相對穩(wěn)定，磷脂酰膽堿分子中C22∶6n-3(DHA)顯著增加，而磷脂酰乙醇胺分子中是C20∶5n-3(EPA)增加，而不是DHA；低溫應激下，虹鱒體內不飽和脂肪酸比例升高，脂肪酸去飽和反應明顯變快，并且在環(huán)境溫度下降時，魚類利用恒黏性調節(jié)(Homeoviscous regulation)來改變生物膜磷脂組成，現(xiàn)已證實高不飽和脂肪酸n-3參與這個調節(jié)過程(Hazel J R,1984)。當水溫從20℃急性降溫至5℃時，虹鱒肝臟和鰓中磷脂酰乙醇(腦磷脂)含量增加而磷脂酰膽堿(卵磷脂)含量相應的減少(Hazel J R,1985)。在遮目魚中也發(fā)現(xiàn)相似的變化（Hsieh S L等，2003）。Dey等(1993)報道，在冷馴化（溫度5～10℃）時，海洋魚類，包括大西洋鯡(Clupea harengus)、云斑鲉杜父魚(Scorpaenichthys marmoratus)、大西洋庸鰈(Hippoglossus hipoglossus)和銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)等和淡水魚類，包括歐鳊(Abramis brama)、粘鱸(Acerina cernua)和白斑狗魚(Esox lucius)等都含有較高的多不飽和脂肪酸。Buda等(1994)報道，在冬季(溫度5℃)時，鯉魚體內不飽和脂肪酸（主要是花生四烯酸和DHA）含量增加。童圣英等(1997)認為，在越冬期時，4種鯉科魚類(Hypophthalmichthys molitrix、Aristichthys nobilis、Cyprinus carpio L.and female grass carp,Ctenopharyngodon idella x male bighead,Aristichthys nobilis)不飽和脂肪酸含量增加，表明n-3PUFA與越冬成活率關系極大，因此，在越冬前加大配合飼料中的n-3PUFA含量，特別是EPA和DHA的含量，增大魚體內的長鏈不飽和脂肪酸的積累，有利于提高其抗寒性。

低溫應激下魚類脂肪酸代謝相關的酶及其基因也發(fā)生相應的變化。隨著水溫下降，羅非魚(Oreochromis mossambicus)脂肪酸去飽和酶(Stearoyl-CoA desaturase)基因的表達增強，它在肝臟中特異性表達，并受體內激素的調控(Hsieh S L等，2004)。當水溫從25℃急性降至15℃時，遮目魚(Chanos chanos)肝臟硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-COA desaturase,SCD)活性顯著升高(Hsieh S L等,2003)。這些變化也進一步表明不飽和脂肪酸含量與魚類抗寒性有著密切的相關性。

低溫應激下魚類脂肪酸組成的變化還表現(xiàn)出組織差異性。Kemp等(1970)報道，低溫應激下金魚(Carassius auratus)全魚層面上的脂肪酸組成并沒有顯著變化，但組織層面上，如腸細胞黏膜的脂肪酸組成發(fā)生顯著變化，其中，發(fā)生最顯著變化的部位是細胞膜的脂肪酸組成。曹永長等(1991)報道，低溫應激下草魚脂肪酸組成有顯著變化的部位是肌肉的線粒體膜。Craig等(1995)報道，低溫應激下眼斑擬石首魚(Sciaenops ocellatus)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的組成比例有顯著變化的部位是肌肉和肝臟。

綜上，魚類可能是通過調節(jié)脂肪酸代謝相關的酶及其基因的表達來改變不同組織細胞膜的脂肪酸組成，從而提高其低溫應激下的抗寒能力。但Dey等(1992)研究發(fā)現(xiàn)，急性降溫后，細胞膜的脂肪酸組成并沒有顯著變化。這可能因為脂類在急性降溫應激中起次要作用，可能存在一些非脂因子，如蛋白質等在這個過程中起主要作用，有關脂類和這些非脂因子的各自作用機制還有待進一步研究。

1.1.3 糖代謝

糖類是低溫應激下魚類的重要能源物質。張瑞霞等(2008)報道，鯽的低溫試驗組(3.5、6.5和9.5℃)血糖濃度低于對照組（溫度20℃）。Sun等(1992)報道，吉富羅非魚血糖濃度在低溫應激12 h后顯著下降。在水溫從25℃降至11℃后冷馴化的13 d里，各組奧尼羅非魚（Oreochermis niloticus×O.aures)血糖含量都下降(賈明亮,2010)。而Hsieh等（2003）發(fā)現(xiàn)，遮目魚在15℃冷馴化24 h后，其血糖含量和磷酸化酶a活力達到最高，果糖1，6-二磷酸酶的活力也顯著升高。

魚類體內的這些糖代謝變化是適應低溫的表現(xiàn)，機體為了抵御寒冷，可能會加快糖的分解利用。以往的研究出現(xiàn)不一致的結果，可能與各自的應激時間有關：在應激初期，糖原轉化成葡萄糖的速率加快，血糖濃度上升；在應激后期，血糖被大量分解生成ATP，以給機體提供能量，此時血糖濃度會降低(常玉梅等，2006)。糖代謝在低溫應激中除了供能外，是否還承擔了與抗應激相關的其他生理功能，以及通過哪種途徑和哪種糖源作為能源還不明確，這也可作為進一步研究的方向。

綜上，為了適應低溫應激，魚類體內三大營養(yǎng)物質的代謝都發(fā)生相應的響應。黃國強等(2010)研究褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚在12℃和17℃低溫應激下對營養(yǎng)物質的利用，發(fā)現(xiàn)其能量代謝的代謝底物以蛋白質和脂肪為主。Pastoureaud(1991)指出,舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)在低溫(3℃和11℃)時肝脂肪下降，利用脂肪產(chǎn)生能量，動用脂肪在于保證糖原水平不至于降至有害于器官代謝的程度。劉波等(2011)報道，吉富羅非魚經(jīng)(9±1)℃冷應激，血清血糖(GLU)水平在6 h，甘油三酯(TG)水平在2、6 h時有顯著升高。曹永長等(1991)認為，低溫(10℃)應激下草魚(Ctenopharyngodon idellus)為了適應低溫，通過調節(jié)不同代謝途徑酶濃度，如顯著降低肝臟中6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)的酶活性，提高乳酸脫氫酶(LDH)的活性，這些與肝臟能量代謝相關酶的變化使肝臟組織發(fā)生了代謝途徑的轉換：肝臟組織中葡萄糖的有效利用受到了抑制，糖酵解作用相對增強，而三羧酸循環(huán)相對減弱，從而有利于機體總代謝，提高抗寒能力。低溫（9～16℃）應激下鯽(Carassius auratus)腸道中蛋白酶和脂肪酶活性顯著低于對照組(25℃)(韓京成等，2010)。由此可認為,低溫應激下的不同魚類可能有著不同的營養(yǎng)代謝策略來提高自身適應低溫的能力。

1.2 低溫應激下魚類免疫生理響應

魚類是變溫動物，水溫不僅影響其自身生理活動，同時也影響其抗氧化防御體系(Martinez-Alvarez等，2005)，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等構成抗氧化酶系統(tǒng)(Sies H,1993）。低溫應激不僅降低魚類的抗氧化能力，從而間接損害免疫系統(tǒng)，還會直接影響免疫生理，如直接影響血細胞總數(shù)、呼吸爆發(fā)功能、細胞胞漿內游離鈣離子濃度（低溫應激引起魚類體內離子運轉機制紊亂，破壞細胞膜的穩(wěn)定性和通透性，弱化Ca2+泵的功能，使細胞膜的主動運輸與滲透壓調節(jié)功能出現(xiàn)障礙，魚類為了提高在低溫下的生存能力，通常采取降低Ca2+滲透性，以維護重要器官如心臟和大腦等的離子穩(wěn)態(tài)）（Ganim等，1998）和其它的免疫相關酶等。其中，轉氨酶以天門冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)的活力最強，當組織細胞，特別是肝臟和心臟等器官的細胞發(fā)生病變時，血清中轉氨酶活力明顯升高(王媛等，2005)，肌酸激酶同工酶(CKMB)主要存在于心肌細胞中，常通過測定其活性升高以反映心肌的受損程度（崔杰峰等，2000）。

楊嚴鷗等（2005）報道，當溫度為10℃時，黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)紅細胞和白細胞的總數(shù)最高；當水溫由25℃（對照組）降至11℃時，奧尼羅非魚血清ALT和AST活力都顯著高于對照組，16～11℃時，紅細胞總數(shù)顯著低于對照組，11℃時，SOD活力在第14 d時顯著低于對照組，CAT活力恢復到對照組水平(賈明亮,2010)；當溫度由16℃降至10℃后冷馴化4 d，鯉紅細胞總數(shù)在冷馴化第1 d顯著升高(常玉梅等，2006)；冬季時，虹鱒白細胞總數(shù)明顯減少，在整個冬季期間，呼吸爆發(fā)強度變化沒有規(guī)律（Morgan等，2008）；冀德偉等(2009)報道，當?shù)蜏貫?.5℃，岱衢族大黃魚隨著低溫脅迫持續(xù)時間(0、12、24、36 h)延長，血清ALT和AST活力升高，而堿性磷酸酶活力和血細胞胞漿內游離鈣離子濃度相比于對照組呈下降趨勢，CK-MB活力在24 h達到最高。當溫度由16℃降至4℃時，鯉血清Ca2+含量顯著下降(常玉梅等，2006)。劉波等(2011)報道，吉富羅非魚試驗組(9±1)℃的ALT水平在冷應激后2、12 h均有顯著升高，AST水平在冷應激2、6、12 h時出現(xiàn)顯著升高。張瑞霞等(2008)報道，當鯽在不同水溫暫養(yǎng)5 d后，低溫組(3.5、6.5和9.5℃)血清AST活力均低于對照組（20℃）。

綜上，不同降溫速率變化的低溫應激下魚類的適應也不同，當水溫緩慢下降時，魚類可能會適應這種變化而達到新的平衡；當水溫急劇下降時，魚類體內的穩(wěn)定狀態(tài)可能被打破，這時低溫成為應激因子，導致魚類免疫反應下降。

2 低溫應激下魚類的損傷程度

從組織、細胞和分子水平檢測低溫應激對水產(chǎn)動物損傷，有助于揭示低溫的應激機制，為提高抗低溫應激能力的研究提供理論基礎。Hochachka等(1988)認為，當外界環(huán)境急劇變化時，會破壞魚類內環(huán)境的穩(wěn)定，導致體內組織的細胞膜受到損傷。內環(huán)境中的活性氧(ROS)會對蛋白質、脂質和DNA等大分子物質造成氧化損傷(Halliwell等，1999)。低溫應激下生物體會因自由基積累而造成氧化損傷，生物呼吸能產(chǎn)生氧自由基，它會使不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應，生成脂過氧自由基(LOO·)，LOO·又可進一步使另一個不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化，從而引發(fā)循環(huán)連鎖反應，形成最終產(chǎn)物——丙二醛(MDA)，膜上脂肪酸過氧化后，流動性降低，通透性增加，大量離子泄漏，引起細胞膜損傷甚至死亡(鄭榮梁等，2001)。體內自由基還可攻擊膜上的(Na,K)-ATP酶，使酶蛋白巰基偶聯(lián)，從而引起酶活性降低，影響膜的離子轉運，造成機體損傷（黃益民等，1998）。

維持魚類體內正常生理功能的必要條件是細胞膜的流動性和完整性。低溫(8.5℃)應激下大黃魚的鰓蓋、腹鰭和臀鰭基部都充血變紅，其肝、腎、心和鰓等組織的細胞膜彈性和流動性都減弱，其膜脂不對稱性導致膜體緊縮不均，從而引起膜的破損滲漏或通透性增大，使細胞內的溶質外流滲入血液，進而改變大黃魚血清生化指標（冀德偉等，2009）。在低溫(10℃)下處理3 d后，淡水白鯧(Colossoma Brachyponum)的細胞在電鏡下可觀察到核質邊聚等現(xiàn)象，經(jīng)Annexin-V-FITC/PI雙染表明絕大部分細胞已經(jīng)進入早期凋亡（嚴文靜等，2005）。

目前，從組織、細胞、DNA和RNA角度檢測不同的降溫幅度對水產(chǎn)動物造成的傷害是一個新領域的探索，只有解決了低溫脅迫下水產(chǎn)動物的營養(yǎng)代謝和免疫功能變化規(guī)律是否與其組織損傷、細胞凋亡有關，才能判斷其應激反應程度。

3 低溫應激下魚類蛋白表達調節(jié)

早在20世紀90年代中期，隨著蛋白質組概念的提出和相關研究技術的迅猛發(fā)展，現(xiàn)在在蛋白質水平上研究低溫應激已成為可能。Devries（1971）在南極魚類的血液中首次發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白(antifreeze protein,AFP)后，對魚類耐低溫研究就開始側重于AFP的研究，經(jīng)多次實驗研究發(fā)現(xiàn)，AFP與抗寒性狀有密切關系(鐘其旺等，2002)。最早在動物尤其是海洋硬骨魚(Righteye floundersdun,Myoxocephalus octodecimspinosis)中發(fā)現(xiàn)的AFP是低溫應激下生物為適應極端寒冷環(huán)境而產(chǎn)生的一類多肽或糖肽(Ewart K等，1999)。隨著基因工程和分子生物學的快速發(fā)展和逐漸完善，AFP得到空前的應用，現(xiàn)已有科學家通過基因工程將AFP的基因轉入到原來沒有AFP的生物體內以提高其抗凍耐寒能力，從而實現(xiàn)不同地區(qū)生物的轉移培育。李晶等(1996)報道，體內轉入AFP的基因的熱帶羅非魚(Oreochromis.massambicus)對低溫有一定的抵抗能力。

應激情況下生物細胞內會迅速合成一種能夠抑制由于ATP損耗引起的細胞凋亡的蛋白質即熱應激蛋白70(HSP70)(Wang Y等，1999)。幾乎所有應激的生物細胞中都經(jīng)常高度地表達HSP70，這賦予了生物體細胞從應激狀態(tài)中恢復的能力，形成對機體的保護性機制，抵御應激對養(yǎng)殖動物的影響。劉波等(2011)認為，急性低溫應激[(9±1)℃]下吉富羅非魚HSP70的mRNA水平在12 h顯著升高，是因為急劇降溫應激可以提高吉富羅非魚肝臟應激蛋白HSP70的mRNA水平，從而影響其非特異免疫力和其它相關的生理指標。

徐鎮(zhèn)等(2007)報道，在急性低溫應激（8.5℃）下，大黃魚肝臟中3個與細胞凋亡密切相關的蛋白質表達下調，分別是N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白(NSF)、角蛋白18(CK-18)和2-Cys Peroxiredoxins(2-Cys Prxs)蛋白，以及與能量需要的應激反應有關的肌球蛋白重鏈(MHC)表達明顯上調。

綜上，魚類對低溫應激的適應可能表現(xiàn)為許多抗應激相關的基因高于平常的轉錄和表達，于是與抗寒相關的蛋白出現(xiàn)大量表達。明確這些基因和蛋白還有待進一步的研究。

4 研究展望

綜上所述，國內外學者近年來對水產(chǎn)動物的低溫應激反應問題已開展了較多研究工作，但是總體而言，目前對水產(chǎn)動物低溫應激反應機制的認識仍不夠深入，以往的低溫研究還存在不足和有待解決的問題，主要體現(xiàn)在以下3個方面：

①目前的低溫研究一般采取急性的冷應激，與實際的水溫逐漸下降情況不符。針對此問題，可借助先進的控溫手段如冷水機等，模擬自然降溫的特點，從而使研究結果更真實地反映魚類在秋冬季降溫時的應激規(guī)律。

②不同的降溫幅度會引起營養(yǎng)代謝和免疫功能等發(fā)生不同的變化，該變化是其抵御惡劣環(huán)境的主動防御，還是因應激損傷的表現(xiàn)？

③在低溫應激過程中，營養(yǎng)代謝、免疫功能、蛋白表達和損傷程度等的相互聯(lián)系？

上述問題的解決將有利于進一步探索有效的措施增強水產(chǎn)動物的抗寒能力，提高魚類在冬天的養(yǎng)成率，降低養(yǎng)殖風險。